肺炎支原体快速培养检测法的临床应用价值评估

张广清，戴洪法，葛晶晶，黄美琼，刘玉线

(清远市妇幼保健院，广东清远 511515)

·论 著·

肺炎支原体快速培养检测法的临床应用价值评估

张广清，戴洪法，葛晶晶，黄美琼，刘玉线

(清远市妇幼保健院，广东清远 511515)

目的 探讨6 h快速检测法、PCR检测法、血清抗体检测法在肺炎支原体(MP)诊断中的价值。方法 选择2012年8月至2014年8月呼吸科收治的140例患者作为研究对象，收集患者入院次日咽拭子进行快速鉴定培养基检测；抽取患者静脉血2 mL，采用ELISA法检测患者MP特异性抗体；取MP快速培养基，对MP基因片段进行PCR扩增。结果 140例患者中共有43例咽拭子培养呈阳性，其中男25例，女18例，年龄2个月至14岁，其中肺炎24例，急性支气管炎9例，慢性肺部疾病10例。MP快速培养法检出阳性率为30.7%(43/140)，PCR检测法检出阳性率为45.0%(63/140)，PCR检测法检出阳性率显著高于MP快速培养法(χ2=4.347,P=0.037)；两种方法一致性检验，kappa=0.554(t=6.868,P=0.000)；MP特异性抗体检出阳性率为37.9%(53/140)，MP快速培养法与特异性抗体检测阳性检出率比较差异无统计学意义(χ2=1.150,P=0.284)；两种方法一致性检验，kappa=0.338(t=4.050,P=0.000)。结论 MP 6 h快速检测法用时短、操作简单，但是依然存在假阳性的可能，将其作为MP诊断指标可能存在一定误差。

肺炎支原体； 快速检测； 酶联免疫吸附法； PCR检测法

肺炎支原体(M.pneumoniae,MP)是一种介于病毒和细菌之间的微生物[1-2]，也是呼吸系统感染常见的病原菌。临床调查显示近年来MP感染呈显著上升趋势[3]，其发病率约占肺炎的15%以上，以婴幼儿最为常见。一直以来血清学检测被认为是诊断MP感染最可靠的手段[4]，然而肺炎支原体IgG于血清IgM之后出现，且持续时间较长，即使诊断出IgG阳性也并非代表MP现症感染[5]，因此其仅在回顾性分析及流行病学调查中有临床价值。PCR检测法具有较高的灵敏度，但是对技术和硬件要求较高，难以在基层推广。MP 6 h快速培养法是近年来国内开发出的新型MP检测方法，其操作简单、准确率高，受到广大临床医生的青睐。本研究对MP 6 h快速培养法、PCR检测法、血清抗体检测法的应用进行比较，旨在探讨MP快速培养法对MP感染的诊断价值，现将研究成果总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年8月至2014年8月儿科收治的140例患者作为研究对象，男72例，女68例,年龄2个月至14岁，其中慢性肺部疾病者43例，急性支气管炎38例，肺炎59例。本研究均取得患者本人同意后签署知情同意书，并经过医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 MP 6 h快速培养法 取无菌试子1支，规范足量采集患者咽后部、扁桃体部位的分泌物或痰液，置于培养瓶中，在瓶内旋转数圈充分混匀后盖上瓶塞，并放入37 ℃恒温箱中培养，培养6 h后读取培养基颜色。判定标准[6]：培养6 h后培养基由红色变为黄色为阳性，培养基颜色无变化为阴性。使用试剂来源于武汉菁华时间科技有限公司。

1.2.2 PCR检测法 痰标本由专人于入院24 h之内用一次性导管鼻腔送入5～8 cm，利于负压吸引的原理，吸取鼻咽分泌物1～2 mL，标本采用实时荧光PCR法检测MP-DNA，操作按标准严格执行，仪器来源于美国ABI-PCR扩增仪，使用试剂来源于深圳亚能生物有限公司。

1.2.3 MP特异性抗体IgM、IgG检测 患儿与入院当天急性期或恢复期分别采集非抗凝静脉血2 mL，2次采血间隔时间为1周，采用酶联免疫吸附法检测患者MP-IgM、IgG抗体，试剂盒来源于德国欧蒙医学实验诊断股份公司(ELISA法)，严格按照试剂盒说明书的操作流程规范操作。判定标准：比值<0.8结果阴性、1.1>比值≥0.8结果可疑、比值≥1.1结果阳性(比值=对照或患者样本的吸光度值/标准品的吸光度值)。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计学软件进行检验，计数资料以率的形式表示，率的比较采用χ2检验，一致性采用kappa检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者一般情况 140例患者中共有43例6 h快速培养呈阳性，其中男25例，女18例，年龄2～14岁，其中临床诊断肺炎24例、急性支气管炎9例、慢性肺部疾病10例。

2.2 MP 6 h快速培养法与PCR检测法比较 MP 6 h快速培养法检出阳性率为30.7%(43/140)，PCR检测法检出阳性率为45.0%(63/140)，PCR检测法检出阳性率显著高于MP快速培养法(χ2=4.347,P=0.037)；两种方法一致性检验，kappa=0.554(t=6.868,P=0.000)，两种方法一致性不高，见表1。

表1 MP快速培养法与PCR检测法比较(n)

2.3 MP 6 h快速培养法与MP特异性抗体检测比较 MP快速培养法检出阳性率为30.7%(43/140)，MP特异性抗体检出阳性率为37.9%(53/140)，两种方法阳性检出率比较差异无统计学意义(χ2=1.150,P=0.284)；两种方法一致性检验，kappa=0.338(t=4.050,P=0.000)，两种方法一致性亦不高，见表2。

表2 MP快速培养法与特异性抗体检测比较(n)

3 讨 论

MP感染常无特异性，好发于儿童和青少年。通常情况下MP感染经过门诊治疗后即可痊愈，然而对于老年或儿童，严重MP感染常表现出严重心内膜炎或肾炎[7-8]。因此，准确诊断MP感染对临床治疗具有重要指导意义。目前临床对于MP感染诊断方法包括血清特异性抗体检测、PCR检测、MP快速分离培养、冷凝集试验等；其中最常用的方法是血清抗体检测。一般MP感染后常于1周出现相应临床症状，此时IgM被检出，至20 d左右达高峰，25周后消失。然而IgG常出现较晚，且持续时间长，即使临床检测IgG抗体阳性也并非代表出现MP现症感染，因此只限于回顾性分析或流行病学调查，对临床治疗价值较小。Li[9]报道证实MP-IgM在发病10 d左右阳性检出率最高，对MP早期诊断较为困难。另外，部分免疫系统缺陷的人群难以产生正常免疫应答，即使发生MP感染也难以产生抗体，导致临床MP检出率偏低[10-11]。

随着分子生物学技术的快速发展，许多病原体核酸的检测方法得以建立，其中多聚酶链式反应(PCR)应用最为广泛。PCR通过体外DNA扩增技术将微量DNA样品迅速扩增百万倍，从而进行序列测定。利用PCR技术可以检测MP的16sRNA、P1蛋白等，其具有较高的敏感度和特异性，检测时间快，还能有效避免交叉反应，被认为是MP感染诊断的发展趋势。目前PCR主要用于衣原体、支原体等生长缓慢或培养困难的病原体鉴定。国外一项报道对血清学、PCR诊断MP感染进行比较[12]，结果显示PCR最高灵敏、可靠。然而PCR需要专业的仪器、操作繁琐，在现阶段难以在基层医院推广，这也是其应用受到限制的客观原因。

MP快速培养检测技术是通过人工液体作为培养介质，主要由MP生长、繁殖所必须的营养物质和抑制其他细菌生长的抗菌药物组成，因此对MP的特异性较强。MP快速培养的工作原理是当MP在培养基内生长后，培养基内pH值会降低，导致培养基颜色由红色变为黄色。目前临床上大量报道均证实MP快速培养对MP诊断的价值。周燕[13]报道称快速培养法与血清特异性抗体检测的一致性较高，这与本研究结论不符。本研究中MP快速培养法检出阳性率为30.7%，显著低于PCR检测法(45.0%)，与MP特异性抗体检出阳性率(37.9%)相比差异无统计学意义。其中MP快速培养法与PCR检测法、MP特异性抗体法检测一致性都偏低，说明MP快速培养法作为诊断MP感染指标仍值得商榷。邱素清[14]报道称快速培养中可能存在真菌生长，导致培养基pH值降低，颜色也随之变化，进而出现假阳性结果。此外，本组中选择的人群包括成人、儿童和老年，在不同年龄组中培养基pH值、抗菌药物用量是否存在差异依然不明确。这最少提示不同年龄组用MP快速检测法检测结果可能会出现偏倚。Ratliff[15]亦证实儿童MP感染者中约有30%培养基存在真菌污染的可能性。另外，支气管肺炎、呼吸道感染患者中同时伴有肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、链球菌等细菌感染，上述细菌在培养基中生长也会导致假阳性的可能。因此，在MP快速培养基鉴定时，培养基的制备方法、抗菌药物用量等还需要进一步改进。

综上所述，MP快速检测法用时短、操作简单，但是依然存在假阳性的可能，将其作为MP诊断指标可能存在一定误差。MP快速鉴定培养基需要对抗真菌及其他细菌感染方面进行技术改进，以避免对结果造成的影响。

[1]曲久鑫,谷丽,吴疆,等.北京地区成年人社区获

得性肺炎中肺炎支原体急性感染的调查[J].中华流行病学杂志,2012,33(5):545-546.

[2]陈正荣,季伟,王宇清,等.肺炎支原体致支气管肺炎和大叶性肺炎患儿的临床及实验室检查特征分析[J].临床儿科杂志,2012,30(8):744-748.

[3]方爱姿,钟亮尹,曾淑珍,等.肺炎支原体抗体检测结果及流行病学分析[J].实用医学杂志,2012,28(15):2611-2613.

[4]张健,李莉,王文龙,等.肺炎支原体抗体分型检测和被动颗粒凝集检测结果比较[J].中华检验医学杂志,2012,35(7):639-642.

[5]Castro AR,Mody HC,Parab SY,et al.An immunofiltration device for the simultaneous detection of non-treponemal and treponemal antibodies in patients with syphilis.[J].Sex Transm Infect，2010，86(7):532-536.

[6]徐明忠,晏群,邹明祥,等.肺炎支原体快速培养法在小儿支原体肺炎诊断中的应用[J].湖南师范大学学报：医学版,2013,28(1):33-35.

[7]刘艳,刘丹,黄泽智,等.湖南地区4 276例急性呼吸道感染患儿肺炎支原体感染状况及药敏分析[J].临床儿科杂志,2015,30(2):195-196.

[8]姜越,刘禧杰,秦选光,等.2011年北京地区儿童肺炎支原体耐药情况及其耐药机制研究[J].中国全科医学,2013,16(32):3778-3782.

[9]Li X,Chen H,You L,et al.Evaluation of the commercial rapid Mycoplasma pneumoniae medium method using the medium PCR and serum antibody test.[J].Clin Lab，2011，57(3):351-355.

[10]李德志,王云龙,李玉林,等.胶体金免疫层析捕获法检测人血清中肺炎支原体IgM抗体[J].郑州轻工业学院学报：自然科学版,2014,4(1):29-32.

[11]李雪辉,陈杭薇,魏娟,等.冬季成人急性呼吸道疾病住院患者肺炎支原体抗体检测及分析[J].临床肺科杂志,2012,17(8):1359-1361.

[12]Komatsu H,Tsunoda T,Inui A,et al.Successful use of saliva without DNA extraction for detection of macrolide-resistant Mycoplasma pneumoniae DNA in children using LNA probe-based real-time PCR[J].Journal of infection and chemotherapy:official journal of the Japan Society of Chemotherapy,2013,19(6):1087-1092.

[13]周燕,申旭霞.快速培养法与实时荧光定量聚合酶链反应检测肺炎支原体的对照研究[J].实用医院临床杂志,2012,9(1):94-96.

[14]邱素清,覃珊珊,向华国,等.儿童肺炎支原体咽拭子快速液体培养结果分析[J].中国微生态学杂志,2012,24(6):552-553.

[15]Ratliff AE,Duffy LB,Waites KB,et al.Comparison of the illumigene mycoplasma DNA amplification assay and culture for detection of Mycoplasma pneumoniae[J].Journal of Clinical Microbiology,2014,52(8):1060-1063.

Evaluation of clinical application value of rapid culture and detection method of Mycoplasma pneumoniae

ZhangGuangqing,DaiHongfa,GeJingjing,HuangMeiqiong,LiuYuxian

(QingyuanMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Qingyuan,Guangdong511515,China)

Objective To explore the value of Mycoplasma pneumoniae(MP) 6 h rapid detection method,PCR detection method and serum antibody detection method in diagnosis of MP.Methods A total of 140 patients admitted in the respiration department of our hospital from August 2012 to August 2014 were selected as the research subjects.The throat swab on the next d of admission was collected for conducting the rapid identification medium detection; 2mL of vein blood was extracted from the patients for detecting MP specific antibody by the ELISA method; the MP fast medium was taken for conducting the amplification of MP gene fragment by PCR.Results Among 140 cases,43 cases of throat swab cultures were positive,included 25 male cases and18 female cases; the age ranged 2?14 years old,in which 24 cases were pneumonia,9 cases were acute bronchitis and 10 cases were chronic lung diseases.The positive rate in the MP rapid culture method was 30.7%(43/140),which in the PCR detection method was 45% (63/140),the PCR detection method was significantly higher than the MP rapid culture method (χ2=4.347,P=0.037); in the consistency test of the two methods,kappa=0.554 (t=6.868,P=0.000); the positive detection rate of MP specific antibody was 37.9% (53/140),which had no statistical difference between the MP rapid culture method and the specific antibody detection (χ2=1.150,P=0.284); in the consistency test of two methods,kappa=0.338(t=4.050,P=0.000).Conclusion The MP 6 h rapid detection method has the advantages of short time and simple operation,but there is still the possibility of false positive,so certain errors may exist with which as the MP diagnostic index.

mycoplasma pneumoniae; rapid detection; ELISA; PCR assay

张广清，男，副主任技师，主要从事临床微生物及免疫学检验研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.009 文献标识码：A 文章编号：1673-4130(2016)07-0890-03

2015-11-15)