葡萄酒酿造过程中12种残留杀菌剂的归趋追踪

王玉路，王宗义，贾昌喜，姜怀玺，李德美，杨曼

(北京农学院 食品科学与工程学院，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，食品质量安全北京实验室，北京北农葡萄酒工程技术中心，北京，102206)



葡萄酒酿造过程中12种残留杀菌剂的归趋追踪

王玉路，王宗义*，贾昌喜，姜怀玺，李德美，杨曼

(北京农学院 食品科学与工程学院，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，食品质量安全北京实验室，北京北农葡萄酒工程技术中心，北京，102206)

摘要追踪了葡萄酒酿造过程中12种残留杀菌剂的归趋，为葡萄酒残留控制提供了有实用价值的数据。结果表明，各杀菌剂的酒渣残留分量为41.63%～95.91%，平均为66.08%； 酒泥残留分量为1.25%～21.40%，平均9.54%； 降解分量为2.43%～40.45%，平均为17.24%，其中酒精发酵期无降解，二次发酵期降解分量为2.09%～17.62%，平均为10.82%，陈酿期(陈酿3个月时)降解分量为0.84%～23.46%，平均为6.42%；酒汁中各杀菌剂的平均残留分量最低，为7.14%，各残留分量分别为多菌灵20.56%、甲霜灵14.32%、精甲霜灵9.34%、嘧霉胺7.15%、烯酰吗啉6.49%、氟环唑2.66%、戊唑醇2.33%、氟硅唑1.71%、咪鲜胺0.40%、吡唑醚菌酯1.00%和腐霉利12.55 %，且与其logP值显著负相关，脂溶性越强，葡萄酒中的残留分量越小。

关键词杀菌剂残留;葡萄酒;酿造;归趋追踪

伴随我国葡萄酒消费量的不断提升[1]和葡萄酒产业的快速发展[2-3]，葡萄酒的质量安全和品质也越来越受到人们的重视。农药残留就是被关注的问题之一，它不仅影响影响葡萄酒的质量安全，还会对感官质量带来不良影响[4]。目前，我国无论是葡萄，还是葡萄酒，在农药残留的控制方面，同国际葡萄酒主产国相比，都相对滞后[5-6]。

关于葡萄酒酿造过程中农药归趋行为的研究，是指导葡萄园合理使用农药，改进酿造工艺，从而最大限度减少酒体中的农药残留，获得高品质葡萄酒的重要依据。研究表明，酿造过程中，葡萄中的残留农药在液固两相进行重新分配，更倾向吸附于酒渣和酒泥[7-9]，再加之酿造过程中的降解[10]，使得残留于酒汁中农药较葡萄原样显著减少。尽管这些归趋行为已基本清楚，但不同性质的农药，其残留转移到酒汁的分量并不相同[11]；又因受用药品种、用药历史和环境特点的影响，不同国家、不同地域葡萄的农药残留情况也不相同。本文根据实验室对葡萄样品的农药筛查分析结果，选择12种经常检出的杀菌剂，使用液相色谱-串联质谱技术，对其实际残留进行了酿造追踪分析，以期为葡萄酒的农药残留控制提供具有实用价值的数据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

玫瑰香葡萄，购自北京昌平区回龙观城北市场； Zymaflore F15酵母菌、果胶酶和酵母营养剂，法国Laffort公司。

固相萃取小柱，Cleanert NH2，500 mg/6 mL，天津博纳艾杰尔科技有限公司；50 mL塑料离心管，BD Bioscience公司。

各种杀菌剂(见表1)定值标准品，质量浓度为100 μg/mL，农业部环境保护科研监测所；色谱乙腈、甲醇和甲苯，Burdick & Jackson, Honeywell公司；色谱级甲酸、乙酸，分析纯无水硫酸钠、6%亚硫酸、无水硫酸镁和无水乙酸钠，北京化学试剂公司。

1.2仪器设备

Agilent 6410 Triple Quad LC/MS系统，Zorbax SB-C18色谱柱(3.5 μm，150 mm×2.1 mm)，美国安捷伦科技有限公司；AWL-1002-U艾科浦超纯水系统，重庆顺洋企业发展有限公司；BT125D电子天平(0.1 mg)，赛多利斯公司；FSH-2可调高速匀浆机，常州国华电器有限公司；IKA-MS3涡旋混合器，德国伊卡公司；BF-2000氮气吹干仪，北京八方科技有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；H1850R离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3葡萄酒酿造与取样

取9 kg经去梗、挑去腐烂和破损籽粒的葡萄，于20 L不锈钢发酵桶中，用不锈钢搅拌棒捣碎。加入9 mL 6 %的亚硫酸溶液混匀，再分别加入0.27 g果胶酶和4.5 g酵母(酵母需提前经37 ℃活化，加葡萄汁培养15 min)搅拌均匀，进行酒精发酵(约7 d)。每天搅拌1次，并测定发酵液的密度，待葡萄汁密度下降到0.995 g/cm3时，发酵完成。将发酵液通过纱布过滤到20 L广口瓶中，盖好盖子，自然启动二次发酵(苹果酸-乳酸发酵)，约10 d左右发酵完成。分离酒泥后，酒液装瓶，加入2滴亚硫酸溶液后，打塞，置于酒窖陈酿。酿造实验进行2个重复。

分别于发酵前采集葡萄样本，于酒精发酵开始、中间、结束时，以及二次发酵结束时，采集浆液和酒汁样本；于酒精发酵和乳酸苹果酸发酵结束时采集酒渣和酒泥样本。葡萄和酒渣样本装于塑料样品袋中，发酵液和酒泥样本分装于50 mL离心管中，所有样本冷冻保存(-18 ℃)。

1.4分析方法

参照GB/T 23206—2008[12]进行。样品经室温解冻后，称取10 g(精确到0.000 1 g)样品于50 mL螺口塑料离心管中(其中葡萄和酒渣需打浆破碎均匀后取样)，准确加入10 mL含体积分数为1%乙酸的乙腈溶液，旋紧盖子，涡旋混合2 min；再加1 g无水乙酸钠，振荡1 min，加4 g无水硫酸镁，振荡2 min，4 200 r/min离心5 min。

将氨基固相萃取柱中装入高约为2 cm经650 ℃脱水4 h的无水硫酸钠，用5 mL乙腈甲苯溶液(3+1，v/v)活化后，移取上述离心清液5.00 mL于小柱上，用25 mL乙腈甲苯溶液(3+1, v/v)洗脱，洗脱液于40 ℃减压浓缩至约0.5～1 mL，再于35 ℃下氮气吹干，用1 mL乙腈水溶液(3+2，v/v)复溶，再经0.22 μm滤膜过滤于进样瓶中，于国标法给定的分析条件下进行色谱分离和质谱检测。

2结果与讨论

2.1葡萄样本中12种杀菌剂的定量结果

根据实验室对葡萄样品的农药筛查结果，选择12种常被检出的杀菌剂，对本次实验用的葡萄样本进行检测，结果见表1，该12种杀菌剂均被检出，但含量远远低于国家食品安全限量，这一定程度上也说明市场上的葡萄农药残留水平是安全的。该12种杀菌剂均为登记可用于葡萄的常用农药品种，其中多菌灵、嘧霉胺、烯酰吗啉、吡唑醚菌酯和腐霉利，有相对较高的残留量。

表1　葡萄中12种杀菌剂的测定结果

2.2葡萄酒酿造过程中各杀菌剂的追踪

不同酿造阶段，12种杀菌剂残留量的定量追踪结果见表2，其中甲基硫菌灵在酿造各阶段的样品中均未检出(以下不再做讨论)。酒精发酵开始时，发酵液中目标杀菌剂的含量明显低于其在葡萄原样中的含量，这是因为发酵液中不包含葡萄表皮和籽的缘故；在酒精发酵阶段各农药没有观察到明显的下降趋势，其中嘧霉胺、吡唑醚菌酯等的浓度还有上升的趋势，这可能是表皮和籽中这2种杀菌剂随着发酵时间的延长逐渐释放到发酵液中造成；酒精发酵结束后的酒渣和二次发酵发结束后的酒泥中目标农药都极显著高于相应发酵液和酒汁；陈酿3个月的酒汁中目标农药与二次发酵结束时相比，目标农药也有显著下降趋势。

2.3葡萄酒酿造过程中各杀菌剂的残留归趋分析

由于不同葡萄品种和不同成熟度，酒汁、酒渣和酒泥的质量分数各不相同，本实验使用的发酵过程中酒汁、酒渣和酒泥的质量分数约为0.8,0.1和0.1。由表2可知，酒精发酵阶段发酵液中的目标杀菌剂没有明显的降解趋势；酒精发酵结束后，根据酒渣和发酵液(酒浆)中目标杀菌剂的含量计算得到的杀菌剂总量与葡萄原样中的杀菌剂总量相当，说明酒精发酵期杀菌剂降解不明显，与CABONI等[9]的报道相一致；同样根据苹果酸-乳酸发酵结束时酒泥和酒汁中目标杀菌剂含量计算获得的总量，明显低于与发酵开始时酒浆中杀菌剂总量，说明苹果酸-乳酸发酵期目标杀菌剂存在明显的降解；陈酿期(3个月)也观察到目标杀菌剂有明显的降解。

表2　不同发酵阶段发酵液中12种杀菌剂残留的监测结果

注：1)本实验数据的偏差小于15%，不再一一列出；2.ND 未检出。

因此，为消除测定误差的影响，可近似用酒精发酵期发酵罐中(酒渣和发酵液)各杀菌剂的总量为基础，对整个酿造过程农药归趋进行分析，见表3。

表3　酿造过程中各杀菌剂的归趋

注：目标农药总浓度 (μg/kg) = 发酵液中目标农药浓度(酒精发酵期)× 0.90 + 酒渣中目标农药浓度× 0.10；

酒渣中的残留分量(%) = 酒渣中目标农药浓度×0.10 / 目标农药总浓度×100；

酒泥中的残留分量(%) = 酒泥中目标农药的浓度×0.10/目标农药总浓度×100；

酒汁中的残留分量 (%) = 酒汁中目标农药的浓度(陈酿结束时) × 0.80/目标农药总浓度×100；

农药总降解分量(%) = 100-酒渣中目标农药的残留分量(%)-酒泥中目标农药的残留分量(%)-葡萄酒中目标农药的残留分量(%)；

二次发酵期降解分量(%) ={发酵液中目标农药浓度(酒精发酵期) × 0.90-酒汁中目标农药的浓度(二次发酵结束)× 0.80-酒泥中目标农药的浓度 × 0.10}/目标农药总浓度× 100;

陈酿期降解分量(%) = 农药总降解(%)-二次发酵期降解分量(%)。

结果表明，酒汁中杀菌剂的残留分量为0.40%～20.56%，平均为7.14%，其中多菌灵、精甲霜灵、甲霜灵、嘧霉胺、烯酰吗啉和腐霉利有相对较高的残留分量，这解释了多菌灵等杀菌剂易于葡萄酒中检出的原因；虽然酒泥中目标杀菌剂的浓度较高，但由于酒泥的质量分数小，其中的杀菌剂残留分量只占1.25%～21.40%，平均为9.54%；杀菌剂的降解主要发生在二次发酵期和陈酿期，到陈酿3个月时杀菌剂降解总分量为2.43%～40.45%，平均为17.24%，其中二次发酵期杀菌剂残留降解2.09%～18.17%，平均为10.82%。酒渣是残留杀菌剂的最主要去向，为41.63%～95.91%，平均为66.08%。

虽然杀菌剂降解分量和酒泥中杀菌剂残留分量都相对较小，但在去除酒渣后，通过酒泥沉淀可去除剩余杀菌剂(发酵液中)平均超过30%(依表3计算)，再通过陈酿期的进一步降解，陈酿3个月时可再去除剩余杀菌剂平均超过50%(依表3计算)，因此，通过酒泥沉淀和适当的陈酿可近一步有效去除葡萄酒中的农药残留。工业酿酒，通常还会加入澄清剂，其中用木炭和做澄清剂时，还会有效吸附部分农药[7],关于使用澄清剂本文不作讨论。

酒汁中杀菌剂的残留水平，除决定于其葡萄的残留水平外，还主要取决于其酒汁的残留分量。将表3中的lgP值与酒汁中相应杀菌剂的残留分量进行回归，还可观察到两者之间呈显著的负相关(R2=0.667)，见图1，lgP值越大，即脂溶性越大，酒汁中对应杀菌剂的残留分量越小，因此可通过杀菌剂lgP值的大小，对其酒汁的残留分量进行判断，这也为指导葡萄园合理用药提供了直观的依据。

3结论

本研究通过对葡萄样品进行杀菌剂的测定和酿造实验，对检出的12种常用杀菌剂进行追踪分析，为葡萄酒中的农药残留控制提供了具有实用价值的数据。研究表明， 葡萄中检出的12种杀菌剂， 除含量较低的甲基硫菌灵之外，其他在酿造的各个阶段均有检出；各杀菌剂酒渣残留为41.63%～95.91%，平均为66.08%，是主要去向；其次是酿造过程的降解，为2.43%～40.45%，平均为17.24%，其中在酒精发酵期没有观测到明显降解，降解主要发生在二次发酵期和陈酿期；再次是酒泥中的残留，为1.25%～21.40%，平均9.54%；酒泥的沉淀，二次发酵和陈酿期降解，在酒渣分离后进一步去除发酵液中的杀菌剂残留发挥重要作用；酒汁中杀菌剂的平均残留最低，仅为7.14%，酒汁中各杀菌剂的残留分量分别为，多菌灵20.56%、甲霜灵14.32%、精甲霜灵9.34%、嘧霉胺7.15%、烯酰吗啉6.49%，氟环唑2.66%，戊唑醇2.33%，氟硅唑1.71%，咪鲜胺0.40%，吡唑醚菌酯1.00%和腐霉利12.55；酒汁中杀菌剂的残留分量与其logP值显著负相关，脂溶性越强，葡萄酒中的残留分量越小。

图1　杀菌剂lgP值与其酒汁中残留分量的关系Fig.1　The correlation between of the residues fraction of fungicides and their lgP values

参考文献

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[11]薛洁，张敬，梁萌萌，等. 葡萄酒中农药残留的调查研究[J]. 酿酒科技, 2014(7): 4-8.

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Fate tracing for 12 residual fungicides in grapes during vinification process

WANG Yu-lu, WANG Zong-yi*, JIA Chang-xi，JIANG Huai-xi,LI De-mei, YANG Man

(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control for Spoilage Organisms and Pesticides, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing Capital Wine Technology & Engineering Center, College of Food Sciences and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)

ABSTRACTThe fate of 12 residual fungicides detected in grapes was traced during vinification process and useful data were provided for the control of fungicides residues in wines. Results showed that fractions of residues in cakes and lees for all fungicides were from 41.63% to 95.91% with an average of 66.08% and from 1.25% to 21.40% with an average of 9.45%, respectively. Fractions of degradation were from 2.43% to 40.45% with an average of 17.24%. Degradation was not observed for all fungicides during alcoholic fermentation, while it occurred mainly during the malolactic fermentation about 2.09%-17.62% with an average of 10.82% and during the storage about 0.84% to 23.46% with an average of 6.42%. The contents of residual fungicides in wine were 20.56% for carbendazim, 14.32% for mefenoxam, 9.34% for metalaxyl, 7.15% for pyrimethanil, 6.49% for dimethomorph, 2.66% for epoxiconazole, 2.33% for tebuconazole, 1.71% for flusilazole, 0.40% for prochloraz, 1.00% for pyraclostrobin, and 12.55 % for procymidone, The lowest average value was 7.14%. Significant negative correlation was observed between the fractions of residual fungicides in wine for and their logP values, which meant that the higher logP value the lower content of residual fungicides in wine.

Key wordsfungicides residues; wine; vinification; fate tracing

收稿日期：2015-02-14，改回日期：2015-04-14

基金项目：北京市教委项目(KM201310020009；PXM2014-014207-000001)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603020

第一作者：硕士研究生(王宗义副教授为通讯作者，E-mail：wangzongyi001@sina.com)。