两种铁角蕨的孢子体形态研究及水分生理测定

李学梅,杨 扬,徐成东

(1.云南大学生命科学院,昆明650091；2.楚雄师范学院化学与生命科学系,云南楚雄675000；3.云南农业大学植物保护学院,昆明650201；4.云南省高校应用生物学重点实验室,云南楚雄675000)

两种铁角蕨的孢子体形态研究及水分生理测定

李学梅1,2,杨 扬3,徐成东2,4∗

(1.云南大学生命科学院,昆明650091；2.楚雄师范学院化学与生命科学系,云南楚雄675000；3.云南农业大学植物保护学院,昆明650201；4.云南省高校应用生物学重点实验室,云南楚雄675000)

以铁角蕨属(Asplenium)两种不同植物的孢子体为材料(石生铁角蕨和变异铁角蕨),通过常规形态解剖方法和水分生理指标测定,分析探讨了这两种植物的形态特征与水分生理特点之间的适应性。结果表明: (1)石生铁角蕨和变异铁角蕨相比较,石生铁角蕨叶面积指数较大,叶片更为饱满。(2)两种铁角蕨表皮细胞的垂周壁均为不规则形,分别呈现出深波状或浅波状。(3)两种铁角蕨的气孔器全为下生气孔,且气孔器类型、形状、气孔大小及长宽比都很稳定。但是,二者之间气孔密度有很大差异,而气孔器类型以不规则四细胞型、腋下细胞型和极细胞型为主。(4)木质部维管束均为椭圆形的双柱型管状中柱,中柱内含有管状分子,呈背对月牙形分布,中柱大小约为80 μm。(5)维管束内的管状分子次生壁出现不同程度的木质化增厚,以网纹、梯纹、孔纹的形式表现出来,管状分子的直径都较小,变异铁角蕨的木质部管状分子比石生铁角蕨的稍大。(6)石生铁角蕨的自然含水量较低,相对含水量较自然含水量变化较小,束缚水与自由水比值和水势较高。从石生铁角蕨和变异铁角蕨的叶表皮形态、气孔器特征、管状中柱和管状分子特征来看,将二者划分在同一属下是比较合理的。两种植物自然生境不同,其水分生理特征差异明显,但均与各自的形态特征相适应；石生铁角蕨的抗旱性比变异铁角蕨更强。该研究结果可为铁角蕨属植物的系统分类和抗旱性研究提供更多的资料。

铁角蕨,表皮细胞,气孔器,管状分子,相对含水量,水势

铁角蕨属(Asplenium)植物隶属于铁角蕨科(Aspleniaceae),该属是铁角蕨科中种类最多、形态变化最大的1个属(吴兆洪和秦仁昌,1991)。铁角蕨属在中国约有110种,分布于全国各地,以热带和亚热带为分布中心(中国植物志,1999)。铁角蕨属不像同科的其它属一样具有十分稳定的染色体基数,多倍体现象十分普遍,属间和种间杂交广泛存在,形态变异非常大。所有的这一切都使得该属的系统分类存在很大的困难。近年来,国内学者关于铁角蕨科植物的研究主要有戴锡玲等(2005)利用扫描电镜对国产铁角蕨科(Aspleniaceae)8属59种植物的孢子形态进行观察,从孢粉学的角度对该科的分类和系统演化进行了探讨；候鑫和王中仁(2000)对中国产铁角蕨(A.trichomanes)进行了种下分类研究；李春香和陆树刚(2006)利用叶绿体rbcL、trnL-F和rps4-trnS序列的证据从分子系统学方面证明云南铁角蕨与泸山铁角蕨是一对亲缘关系非常近的物种；檀龙颜和刘保东(2007)用光学显微镜观察和比较了4种铁角蕨植物的配子体的发育过程从而进行系统分类；邓晰朝等(2006)、王任翔和陆树刚(2010)等对铁角蕨属植物叶表皮微形态和孢子形态进行观察,以期达到对该属植物进行系统分类的目的。蕨类植物的表皮及附属组织特征是分类的重要依据之一。本文通过对两种铁角蕨属植物石生铁角蕨(A.saxicola),变异铁角蕨(A.varians)的孢子体形态进行解剖研究,不仅是从叶表皮微形态方面,还从叶柄横切、维管束形态、叶面积、叶片厚度等方面进行比较分析,判断二者之间的相似程度,同时为铁角蕨属植物的系统分类提供依据。

水分是植物进行正常生理活动的决定性因子之一,水分对植物的重要性体现在水分是植物体的组成部分；参与植物体内的新陈代谢；在植物对环境的适应中起着重要作用。植物组织的总含水量是反映组织水分状况的基本指标。植物体内的水分可分为自由水与束缚水两种类型,束缚水的数量是细胞胶体亲水程度的指标之一,由于它比自由水更加难以被蒸腾出去,因而他们对干旱的抗性较大(陈建勋和王晓峰,2002；潘瑞炽等,2012)。束缚水/自由水比值的高低与植物的生长快慢呈正比,与植物的抗性呈反比(王康英,2011)。然而,在前人的研究中,对铁角蕨科植物的水分生理测定几乎还是一片空白。本文通过测定两种铁角蕨的含水量、自由水与束缚水的比值、水势等指标,来探讨铁角蕨属植物的形态学特征与水分代谢之间的关系,以期为后期铁角蕨科植物的抗旱性研究积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

石生铁角蕨(A.saxicola)和变异铁角蕨(A.vari-ans)的野生植株均采自哀牢山国家级自然保护区(海拔:3 166 m),之后栽培于楚雄师范学院生物温室中。

1.2 实验方法

1.2.1 叶片表皮细胞及气孔器的观察 张秀芳等(2002)采用印迹观察法。取两种铁角蕨植物叶片的中部羽片,刮去其上孢子囊群及附属物,用蒸馏水冲洗干净并自然晾干,将透明指甲油均匀涂刷于羽片上、下表皮,待油膜自然晾干后用镊子轻轻撕下,将叶片表皮油膜模型分别平铺于滴有甘油的载玻片制成临时装片,然后转移到Olympus BX63型光学显微镜观察、拍照。

1.2.2 叶柄横切观察 采用常规形态解剖学研究方法,用双面刀片做徒手切片,解剖针或毛笔挑选薄而完整的切片置于载玻片上用1 番红试剂染色5 min左右,用滤纸吸取多余的染液,用滴管吸取1滴蒸馏水滴于材料处盖上盖玻片制成临时装片,然后转移到Olympus BX63型光学显微镜观察、拍照。

1.2.3叶柄木质部管状分子的制取和观察 将采集到的新鲜蕨类洗净后,取叶柄和根状茎,剥离维管束并剪成0.5～1.0 cm的小段,浸泡于FAA固定液(福尔马林∶冰醋酸∶70 酒精溶液＝90∶5∶5)中保存备用。将材料从固定液中取出并清洗后,浸于Jeffrey离析液(10 铬酸∶10 硝酸＝1∶1)中在室温下离析。将离析好的材料先用蒸馏水漂洗,随后采用乙醇溶液梯度(50 、60 、70 、80 、90 )脱水。制做临时装片,转移到Olympus BX63型光学显微镜观察、拍照。

1.2.4 植物组织含水量和相对含水量的测定 植物组织含水量测定采用烘干法,组织相对含水量采用水分饱和法。鲜重测定:剪取植物材料,装入已知重量和风干过的信封中用电子天平称取鲜重(Fresh weight,Wf)。饱和鲜重测定:将称过鲜重的植物材料浸入水中,数小时后取出,用吸水纸吸干表面水分,立即称重。重复数次,直到两次称重的结果基本一致不再变化,记录此时的读数即为饱和鲜重(Sat-urated fresh weight,Wsf)。干重测定:将称过饱和鲜重的植物材料装入信封中,放入烘箱内,105℃杀青10 min,然后把烘箱的温度降到70～80℃左右,烘至组织恒重。取出信封和材料,放入干燥器中冷却至室温,称量得到干重(Dry weight,Wd)。

取得以上数据后,按式1-1计算组织含水量(Tissue water content,W)和式1-2计算组织相对含水量(Relative water content,RWC)。

1.2.5 植物水势的测定 采用阿贝折射仪法(潘瑞炽等,2012)。配制一系列不同浓度的蔗糖溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L)各5 mL,注入8支编好号的试管中,用折射仪分别测定1～8管的折光系数。用直径5 mm的打孔器在叶片中部靠近主脉附近打取叶圆片,随机取样,浸入1～8号试管中,每管放入相等数目的叶圆片,加塞,放置1 h,其间摇动数次。然后用折射仪再次测定蔗糖溶液的折光系数。前后两次测定其折光系数不变或者变化很小的试管中的糖浓度即为等渗浓度或近等渗浓度。叶片的水势与此种浓度溶液的渗透势相等。

精准扶贫重在“扶”与“贫”，“扶”是“供给”方，“贫”是“需求”方。“供给”体现在通过供给侧改革调整和改善扶贫资源要素供给结构，提高供给质量和效率，指导精准扶贫工作，从而促进贫困对象真脱贫和脱真贫。供给侧改革旨在调整供给结构，最优配置劳力、土地、资本、制度等资源要素，提高经济发展质量，影响长期经济发展。需求侧改革重点集中包括投资、消费、出口在内的三驾马车，影响短期经济发展。“供给侧”和“需求侧”构成对应关系，我们研究重点是“供给侧”，供给侧改革集中在生产要素(含劳力、土地、资本、制度)等主线上推进，见图3。

按式1-3计算叶片细胞的水势。式中,Ψcell为植物细胞水势；Ψout为外界溶液渗透势；i为解离系数,蔗糖溶液为1；c为小液滴在其中基本不动的溶液浓度,单位是mol/L；R为摩尔气体常数,R＝0.083× 105(LűPa)/(molűK)；T为热力学温度,单位是K,即273＋t,t为实验温度,单位是℃。

1.2.6 植物体内自由水与束缚水含量测定 采用阿贝折射仪法(潘瑞炽等,2012)。取生长状况、生长部位、叶龄等较为一致的健康完整叶片5～10片,用直径5 mm钻孔器在叶片中部靠近主脉附近打取叶圆片。先用移液管吸取60 蔗糖溶液5 mL,加到称量瓶中称重得所加蔗糖溶液的重量mB,并用阿贝折射仪测得蔗糖溶液的含糖百分数B1。接着将叶圆片称取鲜重Mf,放入已称重的蔗糖溶液中。小心摇动瓶中溶液,使与样品混合均匀,放在阴凉处4～5 h,期间经常摇动。随后用阿贝折射仪测定浸出液的含糖百分数B2。按式1-4计算植物样品中自由水含量。式中:β为自由水含量( )；mB为加入样品中蔗糖溶液的质量；B1为蔗糖溶液的质量分数；B2为加样后糖溶液的质量分数；Mf为植物样品鲜重。

图版Ⅰ 两种铁角蕨植物叶上下表皮特征(表面观) 1,2.石生铁角蕨；3,4.变异铁角蕨；1,3.上表皮；2,4.下表皮。Plate I Characters of upper and lower epidermis of two species of Asplenium(surface view) 1,2.A.saxicola；3,4.A.varians；1,3.Upper epidermis；2,4.Lower epidermis.

表1 2种铁角蕨属植物叶表皮特征Table 1 Epidermis characteristics of two species of Asplenium

求得自由水含量后,束缚水含量＝组织含水量－自由水含量。

1.2.7 方格纸法测定叶面积 本研究采用方格纸法。将叶片摘取后,平铺于由1 mm2小方格组成的方格纸上,用铅笔描出叶片的形状,然后统计叶片所占的方格数,再乘以每个方格的面积即得到叶片面积。对于处在叶片边缘的不完整方格按实际情况进行取舍,常用的比例为1/2或者1/3,当叶片所占面积大于此值时算一个方格,相反则忽略不计。

1.2.8 游标卡尺法测定植物叶片厚度 随机选取植物叶片10片,叠加在一起,用游标卡尺从不同的角度测定10片叶子的厚度并计数,然后根据平均值计算每一片叶片的厚度。

2 结果与分析

2.1 叶表皮特征和气孔类型

在所观察的铁角蕨属两种植物材料中,气孔器全为下生气孔,即均分布在叶片的下表皮,上表皮无气孔器。气孔类型(Dilcher,1974；Fryns-Claessens＆Van Cotthem,1973)概括起来可分为极细胞型、腋下细胞型、聚腋下细胞型和无规则四细胞型几种,上下表皮细胞的垂周壁呈浅波状、深波状、凹凸状。

从图版I和表1看出,石生铁角蕨上、下表皮细胞为不规则形,垂周壁呈浅波状或凹凸状,细胞多为长条形(图版I:1)；气孔器类型多为腋下细胞型,少部分气孔器为聚腋下细胞型和极细胞型(图版I:2)。

变异铁角蕨上表皮细胞为不规则形,垂周壁呈深波状或无规则凹凸状(图版I:3),下表皮细胞垂周壁也为不规则的深波状；气孔器类型多为无规则四细胞型,少为极细胞型和不等细胞型(图版I:4)。

表2 2种铁角蕨属植物气孔器类型Table 2 Types of stomatal apparatus of two species of Asplenium

图版Ⅱ 两种铁角蕨植物叶柄横切特征 1,2.石生铁角蕨；3,4.变异铁角蕨；1,3.10×10；2,4.10×40。PlateⅡ Characters of leaves stalk cross section of two species of Asplenium 1,2.A.saxicola；3,4.A.varians；1,3.10×10；2,4.10×40.

图版Ⅲ 两种铁角蕨植物管状分子特征 1,2.石生铁角蕨；3,4.变异铁角蕨PlateⅢ Characters of vessel element of two species of Asplenium 1,2.A.saxicola；3,4.A.varians

2.2 叶柄横切解剖学特征

通过对两种铁角蕨植物叶柄横切面的观察,发现两种植物木质部均为双柱型管状中柱；在横切面上呈现两个近椭圆形的木质部中柱(图版Ⅱ)。石生铁角蕨叶柄横切面取材为叶柄中上部,维管束木质部类型为两个近椭圆形的管状中柱,中柱里面具有大量的管状分子,形似两个背对的月牙(图版Ⅱ: 1,2)。变异铁角蕨叶柄横切面取材也为叶柄中上部,维管束木质部类型也为两个近椭圆形的管状中柱,中柱里面具有由大量管状分子组成的一对背对月牙形结构(图版Ⅱ:3,4)。

2.3 叶柄木质部管状分子特征

通过对两种植物叶柄木质部的解剖观察,发现两种植物木质部均有管状分子的存在,管状分子的次生壁具有不同程度的木质化增厚,在壁上呈现出螺纹、环纹、梯纹、孔纹状的木质化增厚形式(图版Ⅲ)。石生铁角蕨(A.saxicola)叶柄中的管状分子次生壁上主要呈现出环纹和孔纹,管状分子大小约为10 μm(图版Ⅲ:1,2)。变异铁角蕨(A.varians)叶柄中亦有管状分子。管状分子大小约为12 μm,管状分子的次生壁增厚形式主要是以螺纹和梯纹的形式体现(图版Ⅲ:3,4)。

2.4 叶面积及叶片厚度的测量

从表3可知,实验所测两种铁角蕨叶片面积为复叶中的一小片,两种植物的叶片均为小型叶,从叶面积特征来看,属于典型的矮小的草本植物；两种植物的叶面积和叶片厚度相差较大,表明两种植物属于不同生长环境。石生铁角蕨叶面积约为214 mm2,叶面积指数较大,从叶面积指数来看,是较为饱满的叶片。叶片厚度约为0.3 mm。变异铁角蕨叶面积约为53 mm2,叶面积指数稍小,饱满度适中,叶片厚度约为0.17 mm。

表3 2种铁角蕨属植物叶面积和叶片厚度Table 3 Leaf area and leaf thickness of two species of Asplenium

2.5 叶片的水分生理

从表4可知,石生铁角蕨和变异铁角蕨的自然含水量分别为65.05 、77.82 ,组织含水量分别为71.78 、89.42 ,束缚水与自由水的比值分别为1.34、1.16,水势分别为－0.71 MP、－0.76 MP。

3 讨论

两种铁角蕨叶片上下表皮细胞的垂周壁均为不规则的深波状或浅波状,这符合在同一属中的植物叶表皮特征基本一致的观点。

表4 2种铁角蕨植物叶片水分情况分布Table 4 Water distribution of two species of Asplenium

两种植物的气孔器全为下生气孔,即气孔器均分布在叶片的下表皮。气孔器的着生位置与许多类群的蕨类植物相似,如凤尾蕨科(徐成东等,2012)、鳞毛蕨科(戴锡玲等,2012)、叉蕨科、风丫蕨科(戴锡玲等,2009)、水龙骨科(邵文等,2011)等。气孔器类型概括起来可分为极细胞型、腋下细胞型、聚腋下细胞型、无规则细胞型、不等细胞型和无规则四细胞型,这几种气孔器中只有极细胞型和腋下细胞型为基本类型,其它类型均与基本类型很相似(无规则细胞型除外)。虽然,每一种蕨类植物均有一种主要的气孔器类型,如石生铁角蕨气孔器类型多为腋下细胞型,少部分气孔器为聚腋下细胞型和极细胞型；变异铁角蕨气孔器类型多为无规则四细胞型,少数为极细胞型和不等细胞型,但均印证了同一科中气孔类型相似这一规律。气孔器的长宽比较为稳定,特别是在同一个属中的两种植物中,长宽比差异不超过0.2。石生铁角蕨的长宽比为1.21,变异铁角蕨的长宽比为1.33,二者长宽比的差值为0.12。

从两种植物叶柄横切来看,两种植物木质部均为双柱型的椭圆形管状中柱；中柱大小约为80 μm,中柱中维管束呈背对月牙形的维管束。维管束内存在明显的管状分子,次生壁出现不同程度的木质化增厚,以网纹、环纹、梯纹、孔纹的形式表现出来,管状分子的直径都较小,石生铁角蕨的管状分子大小约为10 μm,变异铁角蕨的木质部管状分子稍大,约为12 μm,这与自身水分代谢也存在一定关系。

综上所述,依据两种铁角蕨的叶表皮细胞特征、气孔器类型的长宽比、木质部的横切面中上中柱的特征、管状分子形态和大小共同说明了把石生铁角蕨和变异铁角蕨分在铁角蕨科铁角蕨属铁角蕨组是较为合理的。

从叶片面积、厚度,叶片水分生理测定结果来看,石生铁角蕨叶面积约为214 mm2,叶面积指数较大,叶片厚度约为0.3 mm,是较为饱满规则的叶片,也正符合本植物叶片无深裂的特征。变异铁角蕨叶面积较小,约为53 mm2,叶面积指数稍小,叶片厚度约为0.17 mm,饱满度适中,和本植物叶片有轻度裂痕相符合。

石生铁角蕨的自然含水量较低,约为65 ,相对含水量较自然含水量变化较小,仅增加了6 左右,束缚水与自由水的比值约为1.34,水势也稍高,约为－0.71 MPa。变异铁角蕨自然含水量约为78 ,相对含水量较自然含水量变化较大,增加了11 左右,束缚水与自由水含量的比值约为1.16,水势约为－0.76 MPa。

两种植物气孔均为椭圆形,其大小差异不大,但是密度差异明显,石生铁角蕨的气孔密度明显小于变异铁角蕨。因为植物的气孔密度和蒸腾大小有密切联系,联系前述水分生理指标来看,我们认为石生铁角蕨的抗旱性强于变异铁角蕨。

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Sporophytic morphology characteristics comparison and water physiological indexes measurement of two pteridophytes in Asplenium

LI Xue-Mei1,2,YANG Yang3,XU Cheng-Dong2,4∗

(1.College of Life Sciences,Yunnan University,Kunming 650091,China；2.Department of Chemistry and Life Sciences,Chuxiong Normal
University,Chuxiong 675000,China；3.College of Plant Protection,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China；
4.Key Laboratory of Applied Biology of Colleges and Universities in Yunnan Province,Chuxiong 675000,China)

Taking two different sporophytes of Asplenium,Asplenium saxicola and A.varians as materials,we studied the morphological characteristics through conventional anatomical method,and water physiological indexes to compare the applicability of morphological characteristics and water physiological characteristics.The results were as follows: (1)The area of pinnule of A.saxicola was about 214 mm2and its thickness was about 0.30 mm,and the leaf area in-dex was about 0.74.The area of pinnule of A.varians was about 53 mm2and its thickness was about 0.17 mm,and the leaf area index was about 0.65.Leaf area index of A.saxicola was more larger than A.varians. (2)Their epidermal cells were irregular shape and anticlinal walls were repand or sinuate type. (3)The stomatal structure of two pterido-phytes in Asplenium were all swells,which indicated that all stomata distributed in the lower epidermis,not in the ad-axial epidermis.And stomatal type,shape,size and aspect ratio were stable,the average length mainly in the region of 30－36 μm,the average width of the distribution in 20－28 μm region,the aspect ratio of 1.21 in A.saxicola and the A.varians was 1.33,their aspect ratio of the difference of 0.12,not more than 0.2.But their stomatal type mainly in-clude polocytictype,coaxillocytictype,anomotetracytictype,and the stomata density were significantly different,72 Nun/mm2and 112 Nun/mm2. (4)Xylem vascular bundle were oval double column siphonostele,tracheary elements were back-to-back crescent-shaped,the siphonostele was about 80 μm. (5)The secondary wall of tubular molecules in the vascular bundle appeared different degrees of lignification thickening,both characteristic of tubular molecules,reticulate toroid and scalariform were observed,their diameters were small,the tubular molecules of A.varians was slightly larger than A.saxicola. (6)Relative water content of A.saxicola was about 65 ,and its natural moisture con-tent was smaller than the relative water content,only increased by about 6 ,ratio of bound water and free water was 1.34,and the water potential－0.71 MPa.Relative water content of A.varians was about 78 ,its natural moisture content larger than the relative water content,increased by about 11 ,ratio of bound water and free water was 1.16,and the water potential－0.76 MPa.And the drought resistance of A.saxicola was stronger than A.varians.The two fern plants were different in water physiological indexes,but adapted to their morphological characteristics.Therefore,it was relatively reasonable to classify A.saxicola and A.varians to be the same genus,based on the leaf epidermis mor-phology,stomatal characteristics,xylem vascular bundle and tubular molecules characteristics of view.The study would accumulate more information for Asplenium and drought studies.

Asplenium,epidermal cells,stomatal apparatus,tubular,relative water content,water potential

Q945,Q944

A

1000-3142(2016)02-0224-07

10.11931/guihaia.gxzw201312047

李学梅,杨扬,徐成东.两种铁角蕨的孢子体形态研究及水分生理测定[J].广西植物,2016,36(2):224－230

LI XM,YANG Y,XU CD.Sporophytic morphology characteristics comparison and water physiological indexes measurement of two pteridophytes in Asplenium [J].Guihaia,2016,36(2):224－230

2015-03-15

2015-06-25

国家自然科学基金(31260095)；云南省高校应用生物学重点实验室建设项目[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31260095)；Project of Key Laboratory of Applied Biology of Colleges and Universities in Yunnan Province]。

李学梅(1989-),女,云南大姚人,硕士研究生,主要从事植物生理生态学研究,(E-mail)lxmzoe＠163.com。

∗通讯作者:徐成东,博士,教授,主要从事植物学与植物生态学研究,(E-mail)chtown＠cxtc.edu.cn。