响应面法优化大孔树脂纯化山药多糖工艺

李　妍，李　锋，曹珂珂，王明杰，王　娣，许　晖

1.蚌埠学院食品与生物工程系，安徽蚌埠，233030；

2.南京军区总医院血液科，江苏南京，210002



响应面法优化大孔树脂纯化山药多糖工艺

李妍1，李锋2，曹珂珂1，王明杰1，王娣1，许晖1

1.蚌埠学院食品与生物工程系，安徽蚌埠，233030；

2.南京军区总医院血液科，江苏南京，210002

摘要：针对一般方法较难纯化山药多糖，选择不同型号大孔树脂，在单因素实验基础上，利用Box-Benhnken中心组合设计原理、三因素三水平响应面分析法，以静态吸附率为指标进行试验，模拟二次多项式回归方程的预测模型，确定最佳吸附条件：吸附温度为29.29℃、D101加入量为2.5 g和吸附时间19.67 h。此条件下，最佳吸附率为67.39%，解吸附实验得出解吸附率为77.52%。实验结果稳定可靠。

关键词：山药多糖；响应面法；大孔树脂；静态吸附；解吸

山药(Rhizomadioscoreae)为薯蓣科(Dioscoreaceae)多年生宿根蔓性草本植物[1]，其地下块茎具有补肾、健胃、补脾、止泻、益精、化痰等功效，是我国传统的药食同源植物。山药中含有多糖、淀粉、淀粉酶、蛋白质、氨基酸、维生素、皂苷、胆碱以及多种微量元素等营养成分，其中多糖是山药的主要生物活性成分，具有多种功能[2-4]。近些来，药物多糖已为规避治疗肿瘤常规的化疗开辟了新的研究领域[5]，越来越多的学者开始关注植物多糖的提取。目前，山药多糖的提取和纯化技术工艺水平还不完善，需要学界进一步研究。本实验采用响应面法优化大孔树脂纯化山药多糖，以期得到较好的山药多糖纯品。

1材料与方法

1.1材料与试剂

市购水山药，粉碎，过40目筛，密封储存于磨口玻璃瓶中，备用。

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、95%乙醇、无水乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮、石油醚、氢氧化钠、盐酸，均采用分析纯试剂；大孔树脂(D101，AB-8，NKA-Ⅱ)购自天津大学化工厂。

1.2仪器与设备

气浴恒温振荡器SHZ-82(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，JK-800DB型数控超声清洗器(合肥金尼克机械制造有限公司)，旋转蒸发器RE-2000B(巩义市予华仪器有限责任公司)，数显恒温水浴锅HH-1(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，电子天平AB323(上海海康电子仪器厂)，722可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，XFB-200高速中药粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)。

1.3试验方法1.3.1葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取0.1 g葡萄糖标准品，置于100 mL容量瓶中定容，摇匀；再移取10 mL于100 mL容量瓶中定容，摇匀，得到0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液；从中移取标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于试管中，分别加入蒸馏水至2 mL，再加入5%苯酚溶液1 mL，后迅速滴加5.0 mL浓硫酸摇匀。将7份样品置于水浴锅中沸水浴15 min，冷却后在490 nm下测量吸光度。以葡萄糖溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，作标准曲线，得到线性回归方程：y=11.036x-0.0015，R2=0.9995，见图1。

1.3.2超声水提取山药多糖1.3.3大孔树脂的选取

选取处理过的大孔树脂D101，AB-8，NKA-Ⅱ加入1 mg/mL葡萄糖标准溶液， 25℃恒温振荡25 h。利用苯酚-硫酸法计算得出山药多糖的浓度，进而计算出大孔树脂的静态吸附率[4]，见下式①②。

用80%乙醇溶液在25℃恒温振荡24 h回收大孔树脂，计算得出静态解吸附率，如下式③。

吸附容量CA[mg/(g·树脂)]=[(C0-C1)

×V1]/m1

①

吸附率=[(C0-C1)/C0]×100%

②

解吸附率t=[(C2×V1)/(m1×CA)]×100%

③式中，C0为初始葡萄糖液的质量浓度(mg/mL)，C1为吸附后上清液中葡萄糖的质量浓度(mg/mL)，C2为解吸液中葡萄糖的质量浓度(mg/mL)，V1为样液的体积(mL)，m1为树脂干质量(g)，CA为吸附容量(mg/g)。

图1　葡萄糖标准曲线

1.3.4大孔树脂吸附率的单因素实验1.3.4.1响应面法对静态吸附条件的优化

实验在单因素实验结果的基础上，依据Box-Benhnken设计，以大孔树脂D101的静态吸附率为考察目标，分别以树脂加入量、吸附时间、吸附温度为三因素。实验因素水平编码见表1。

表1　响应面分析因子及水平表

1.3.4.2解吸附

分别用蒸馏水,40%、50%、60%、70、80%、90%、100%乙醇各30 mL进行解吸附，比较解吸附率。

1.3.4.3验证实验

根据响应面法实验结果，按照最佳吸附条件做三组平行实验，取平均值，比较静态吸附率；根据最佳解吸附结果，用最佳解吸附条件做三组平行实验。

2结果与分析

2.1大孔树脂的选取

三种大孔树脂的静态吸附与解吸附结果见表2。D101与AB-8的静态吸附率与解析率相差不大，均比NKA-Ⅱ效果好，其中D101的静态吸附率略低于AB-8，但解析率比AB-8高，因此综合考虑，D101效果更好。

表2　三种大孔树脂的静态吸附与解吸附

2.2单因素实验结果分析2.2.1大孔树脂加入量对静态吸附的影响

在气浴恒温振荡器中振荡吸附24 h、温度为25℃的条件下，得到不同大孔树脂量与静态吸附的关系，如图2。随着树脂加入量增加，静态吸附逐渐提高，并且趋势逐渐变缓。

图2　树脂加入量对静态吸附的影响结果

2.2.2吸附时间对静态吸附的影响

在温度为25℃、树脂加入量为2.5 g的条件下，得到不同时间对大孔树脂静态吸附的关系，如图3。时间在6～12 h之间，静态吸附率随时间增加而快速增加，12 h后变化不明显。

图3　吸附时间对静态吸附影响结果

图4　温度对静态吸附影响结果

2.2.3吸附温度对静态吸附的影响

在气浴恒温振荡器中振荡吸附24 h、树脂加入量为2.5 g的条件下，得到不同温度对大孔树脂静态吸附的关系，如图4。随着吸附温度的增加，静态吸附率的变化不大，所以吸附温度对静态吸附率无明显的影响。

2.3响应面法设计及结果

根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，结合单因素实验结果，选取有效影响范围，设计出三因素三水平的响应面分析实验，见表3。

表3　Box-Behnken实验设计及结果

表4　回归方程方差分析表

注：*表示影响显著(0.01

运用Design Expert软件分析，以吸附温度、吸附时间和D101加入量为响应变量，以静态吸附率为响应值，进行回归拟合分析，可得到模型如下：

Y=66.34+0.56A+2.99B+0.80C-0.82A2-2.67B2-0.79C2-0.45AB+0.28AC-0.18BC

表中，FA=8.82，FB=248.72，FC=17.84，所以各因素对静态吸附率的影响程度大小为：吸附时间>D101加入量>吸附温度。

响应面法优化D101对山药多糖静态吸附率的最佳方案：吸附温度29.29℃，吸附时间19.67 h，D101加入量为2.50 g，此条件下理论静态吸附率为67.39%。

采用交互作用组图即可对两两因素交互影响山药多糖吸附率的效应进行分析和评价。由图5可以看出，3个响应曲面开口均近视为向下的凸形曲面，并且等高线中最小椭圆的中心在所选的-1～1范围内，说明响应值在3个因子设计的范围内存在最大值。分析各图，两两因素的交互关系均不明显，说明各因素间交互效应不显著，比较几个图可以看出，B(即吸附时间)对响应值的影响最大，表现为Y值的变换最大。

图5　两因素交互作用对吸附率影响的响应面及等高线图

2.4解吸附结果分析

对大孔树脂D101分别用不同浓度的乙醇溶液进行解吸附，得出如图6结果。从中可以看出，D101的解吸附率先是随着乙醇浓度的提高而增加，后逐渐减少，在80%浓度下达到解吸附率最大值78.8%。

图6 乙醇浓度对解吸附率的影响

2.5验证实验

响应面法分析得到山药多糖的最佳纯化工艺，然后进行验证实验。选择温度为30℃、吸附时间为19.5 h、D101加入量为2.5 g的条件进行三组平行实验，实验结果如表5。

表5　山药多糖大孔树脂纯化验证试验结果

3结论

根据实验结果，分析三种大孔树脂D101、AB-8和NKA-Ⅱ的综合吸附与解吸附，得出最佳大孔树脂为D101；单因素实验得出，树脂加入量(即D101加入量)与吸附时间均对静态吸附率产生影响，而吸附温度则影响不大。由响应面法分析得出，山药多糖的纯化条件为：吸附温度29.29℃、吸附时间19.67 h、D101加入量为2.50 g。在此条件下，得出最大静态吸附率为67.39%；由解吸附实验得出，大孔树脂D101最佳解吸附的乙醇浓度为80%。在此条件下山药多糖的纯化率较好，结果稳定可靠。

参考文献：

[1]袁书林．山药的化学成分和生物活性作用研究进展[J]．食品研究与开发，2008，29(3)：176-179

[2]魏涛，何培新，郑俊丽．铁棍山药水溶性多糖的超声波提取工艺及体外抗氧化活性的研究[J]．河南工业大学学报:自然科学版，2010，31(6)：25-28

[3]Samavati V,Manoochehrizade A. Polysaccharide extraction from Malva sylvestris and its anti-oxidant activity[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,60:427-436

[4]李金忠，马海乐，吴沿友．山药多糖的超声辅助提取技术研究[J]．食品研究与开发，2005，26(4)：72-75

[5]葛立军，朱振洪，沙跃，等．正交实验优化复合酶法提取山药多糖工艺研究[J]．时珍国医国药，2010，21(12)：3187-3188

[6]王娜，潘治利，孙晓瑞，等．铁棍山药水溶性粗多糖提取工艺的研究[J]．江西农业学报，2010，22(12)：106-109

[7]杨宏莉，李少春，张伟伟，等．山药多糖的药理作用[J]．医学研究与教育，2010，27(3)：80-82

[8]贾艳．山药多糖的药理学研究[J]．中国医药指南，2012，10(9)：54-55

(责任编辑：汪材印)

中图分类号：TQ461

文献标识码：A

文章编号：1673-2006(2016)02-0112-04

作者简介：李妍(1982-)，女，安徽蚌埠人，硕士，助教，主要研究方向:天然药物的提取与分离纯化。

基金项目：蚌埠学院重点学科建设项目“农产品加工与贮藏”；安徽省教育厅省级质量工程项目“卓越工程计划——食品质量与安全”(2013zyjh040)。

收稿日期：2015-11-12

doi:10.3969/j.issn.1673-2006.2016.02.031