利用线粒体COI和微卫星标记分析文蛤7个地理群体的遗传变异

李宏俊，张晶晶，2，袁秀堂，*，张安国，柳圭泽，邵魁双，王立俊

1国家海洋环境监测中心，大连　1160232大连海洋大学，大连　1160233辽宁医学院，锦州　121001



利用线粒体COI和微卫星标记分析文蛤7个地理群体的遗传变异

李宏俊1，张晶晶1，2，袁秀堂1，*，张安国3，柳圭泽1，邵魁双1，王立俊1

1国家海洋环境监测中心，大连116023
2大连海洋大学，大连116023
3辽宁医学院，锦州121001

摘要:利用线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)和微卫星标记分析了文蛤7个地理群体(朝鲜新义州，辽宁丹东、蛤蜊岗和盘山，山东东营，江苏如东和启东)的遗传多样性和群体分化。PCR扩增获得142条602 bp的COI核苷酸片段，比对到13个变异位点，包括11个转换和2个颠换，定义了22个单倍型，共享单倍型12个，新义州、丹东和启东群体分别拥有特有单倍型。单倍型多样性最高的是如东群体(h=0.900)，最低的是东营群体(h=0.600);核苷酸多样性最高的是丹东群体(π=0.00350)，最低的是蛤蜊岗群体(π=0.00115)。基于COI数据的Fu's Fs中性检验和核苷酸不配对分析揭示文蛤种群历史上曾经历过群体扩张事件。分子变异分析(AMOVA)表明，群体内遗传变异占71.64％，群体间遗传变异占28.36％，群体间发生显著的遗传分化(P＜0.05)。7个微卫星标记扩增280个个体共获得54个等位基因，平均等位基因数为7.7个，平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.3878和0.7996。江苏群体具有较高的遗传多样性，但7个群体间遗传多样性不存在显著差异(Kruskal-Wallis检验，P＞0.05)。Hardy-Weinberg平衡检验结果显示49个群体-位点组合中有18个偏离平衡(P＜0.05)，表现为杂合子缺失。单倍型邻接(NJ)树显示聚类未展示地域性特色，但某几个同一或者相近地理群体的单倍型具有聚类现象(如东和启东部分单倍型出现地理聚类)。依据群体间遗传距离以Kimura 2-parameter为模型建立UPGMA系统发育树，显示丹东群体和江苏的如东和启东群体聚为一支，暗示江苏苗种的异地养殖已经污染丹东文蛤的遗传背景。

关键词:文蛤;群体遗传变异;细胞色素氧化酶亚基I;微卫星;增殖放流

李宏俊，张晶晶，袁秀堂，张安国，柳圭泽，邵魁双，王立俊.利用线粒体COI和微卫星标记分析文蛤7个地理群体的遗传变异.生态学报，2016，36(2): 499-507.

Li H J，Zhang J J，Yuan X T，Zhang A G，Liu G Z，Shao K S，Wang L J.Genetic diversity and differentiation of seven geographical populations of hard clam(Meretrix meretrix)assessed by COI and microsatellite markers.Acta Ecologica Sinica，2016，36(2): 499-507.

文蛤(Meretrix meretrix)是我国重要的滩涂经济贝类，在我国辽宁辽河口、山东蓬莱湾、江苏南部和广西北部湾等地广泛分布［1］。近年来，我国文蛤养殖业发展迅速，但苗种供应制约产业发展［2］，大规模苗种异地养殖造成我国文蛤种质遗传背景混杂［3］。产业发展初期，文蛤养殖苗种依赖于采捕天然苗种，尤其近年来受围填海工程和环境污染等因素影响，我国野生文蛤资源严重衰退［2］。为遏制我国野生文蛤资源衰退趋势，基于文蛤增殖放流方式的资源恢复势在必行，但由于我国文蛤地理群体的遗传背景模糊，放流群体对当地野生资源的负面影响无法评估，因此开展文蛤不同地理种群的分子遗传学研究，对我国文蛤种质资源的修复和保护具有重要意义。

细胞色素C氧化酶亚基I(COI)来源于线粒体DNA，基因变异大、进化速率快，在贝类分子系统发生［4-6］和种群遗传结构分析［7-9］等领域应用广泛。微卫星(Microsatellite)来源于核基因组，是由1—6个碱基重复单位首尾相连组成的串联重复序列，微卫星标记具有数量多、分布广、共显性遗传和多态信息含量高等特点，被广泛应用于群体遗传分析［10-11］、亲缘关系鉴定［12］和遗传连锁图谱构建［13-15］等研究中。考虑到增殖放流文蛤苗种的可操作性，应尽可能选择地理距离近的群体放流，本研究聚焦于我国北方文蛤群体，以朝鲜群体作为参照，利用线粒体COI和微卫星2种标记分析了我国北方6个文蛤地理群体和1个朝鲜群体的遗传多样性和群体分化，以期为我国文蛤种质资源保护和修复提供理论指导。

1材料与方法

1.1样品采集和DNA提取

本研究所用文蛤来源于7个地理群体，分别采自朝鲜新义州，辽宁丹东、蛤蜊岗和盘山，山东东营，江苏如东和启东(图1)，每个地点随机采集40个样本，活体解剖取闭壳肌，保存于80％酒精中，用于DNA提取。采用常规酚/氯仿/异戊醇法提取基因组DNA，利用1％的琼脂糖电泳和紫外分光光度计进行定量，无菌超纯水稀释至50 ng/μL备用。

图1　本研究文蛤地理群体采集点矢量图Fig.1 Collection locations of hard clam geographical populations in this study

1.2线粒体COI序列扩增

文蛤线粒体COI引物来源于通用引物LCO1490和HCO2198［16］，为了提高扩增效率，稍加改动，上游序列为MmCOIF: TTTAGTACTAATCATAAAGATATTG，下游序列为MmCOIR: TACACTTCAGGATGACCAAAAAATCA。PCR反应体系为25.0 μL，内含10×PCR buffer 2.5 μL(含Mg2+25 mmol/L)，正、反向引物各1.0 μL(10 μmol/L)，dNTP 1.5 μL(各含2.5 mmol/L)，Taq酶1 U，模板1.0 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，反应35个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶，送上海生工进行PCR产物测序。

1.3微卫星标记

查阅已发表文蛤微卫星引物文献［17-18］，筛选多态性高、扩增效果好的7个微卫星标记用于群体遗传分析，其引物序列、等位基因数、等位基因大小、重复单元和GenBank登录号等信息见表1。PCR反应体系为15 μL，内含10×buffer 1.5 μL(含Mg2+25 mmol/L)，正、反引物各0.5 μL(10 μmol/L)，dNTP 1.0 μL(各含2.5 mol/L)，Taq酶0.5 U，模板1.0 μL。PCR程序为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，最适退火温度复性30 s，72℃延伸30 s，反应35个循环后，72℃延伸10 min。微卫星标记PCR产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，300 V恒电压1.5 h，紫外灯拍照。

表1　本研究中所用7个微卫星标记引物序列、等位基因数、有效等位基因数、等位基因大小、近交系数、重复单元和GenBank登录号Table 1　Primer sequence，allele number，effective allele number，allele size，FIS，repeat motif and GenBank accession number of seven microsatellite markers used in this study

1.4数据统计与分析

利用Mega 4.0［19］对COI序列进行对位排列，结合人工核查，利用DNASP［20］统计单倍型，计算每个群体的单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)。利用Arlequin 3.5［21］计算群体分化指数(Fst)，分析群体内和群体间的分子方差(Analysis of Molecular Variance，AMOVA)，并进行Fu`s Fs检验和核苷酸不配对分布分析。利用TCS 1.21［22］构建单倍型网络图，以Kimura 2-parameter模型分别建立单倍型Neighbor-Joining(NJ)进化树以及7个群体的Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean(UPGMA)系统进化树，利用Geodis 2.6［23］检测单倍型与地理学特征的相关性。

借助Gel-Pro(Media Cybernetics，USA)统计微卫星标记基因型，利用FSTAT［24］统计微卫星位点的等位基因数、有效等位基因数、近交系数(FIS)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)，利用非参数分析(Kruskal-Wallis test)检验群体间差异显著性。利用Arlequin计算群体分化指数(FST)，用Bonferroni［25］法对多重比较的显著水平进行校正。利用MICRO-CHECKER［26］检测无效等位基因概率。采用马尔科夫链(Markov Chain)方法进行Hardy-Weinberg平衡检验。

2　结果

2.1群体内遗传变异

对7个文蛤地理群体的总DNA进行PCR扩增，获得特异性的COI基因片段，经Mega同源排序，去除部分端部序列，获得142条602bp的COI基因片段，经BLAST比对分析，确认所得片段为COI序列。序列组成显示平均A、T、G、C碱基含量分别为21.2％、45.3％、19.4％、14.1％，A+T含量大于G+C的含量，具有明显的碱基组成偏倚性。602bp的片段共鉴定出13个变异位点(占位点总数的2.16％)，包括11个转换和2个颠换，没有插入和缺失突变，共检测出22个单倍型(GenBank登录号: KJ657746-KJ657749，KJ657752-KJ657769)，共享单倍型12个，占总数的54.5％，Hap01被3个群体共享(朝鲜蛤蜊岗、和盘山)，Hap02被6个群体共享(朝鲜、丹东、蛤蜊岗、盘山、如东和启东)，Hap03被5个群体共享(蛤蜊岗、盘山、东营、如东和启东)，Hap04被5个群体共享(朝鲜、东营、盘山、蛤蜊岗和如东)，Hap05被2个群体共享(朝鲜和盘山)，Hap06被3个群体共享(丹东、如东和启东)，Hap08被4个群体共享(朝鲜、丹东、如东和启东)，Hap13被3个群体共享(朝鲜、盘山和东营)，Hap14、Hap15、Hap16和Hap17分别都被2个群体共享(启东和如东)。Hap07和Hap12是新义州特有单倍型，Hap09、Hap10和Hap11是丹东特有单倍型，Hap18、Hap19、Hap20、Hap21和Hap22是启东特有单倍型。文蛤7个地理群体的遗传学参数见表2，平均单倍型及核苷酸多样性处于中等水平(h=0.886，π=0.00314)。单倍型多样性最高的是如东群体(h = 0.900)，最低的是东营群体(h = 0.600);核苷酸多样性最高的是丹东群体(π=0.00350)，最低的是蛤蜊岗群体(π=0.00115)。总体来说，来自江苏的两个群体显示出较高的遗传多样性。

表2　基于COI和微卫星标记的文蛤7个群体的遗传学参数Table 2 Genetic diversity indices for cytochrome c oxidase subunit(COI)gene and microsatellite markers for seven populations of the hard clam，Meretrix meretrix

中性检验结果显示，平均Fu`s Fs值为－11.97063(P＜0.05)(表3)，Fu`s Fs值达到显著水平，表明文蛤偏离中性选择，曾经历群体扩张事件。核苷酸不配对分布分析的结果表明，文蛤观测到的核苷酸不配对分布呈单峰类型，符合群体扩张模型下的预期分布(图2)。基于观测值和模拟值间的拟合优度检验结果显示，平方离差之和(Sum of squared deviations，SSD)较小，且统计检验不显著(P＞0.05)，表明观测值与模拟值拟合程度较好，符合群体扩张模型，与中性检验结果一致。

表3　基于COI序列的文蛤7个群体的选择中性检验和核苷酸不配对分析Table 3 Selective neutrality test and mismatch distribution analysis of 7 populations of hard clam(Meretrix meretrix)based on COI sequences

图2　文蛤线粒体细胞色素氧化酶亚基I(COI)单倍型的核苷酸不配对分布Fig.2 Mismatch distributions of Meretrix　meretrix　COI haplotypes

分单倍型之间只保留1步变异，仅少数单倍型之间(Hap06→Hap12、Hap06→Hap16、Hap12→Hap10和Hap21→Hap11)保留2步变异。启东拥有13种单倍型，如东拥有9种单倍型，新义州拥有8种单倍型，盘山拥有6种单倍型，丹东拥有6种单倍型，蛤蜊岗拥有4种单倍型，东营拥有3种单倍型。如东群体的单倍型大部分和启东相同，仅Hap04是如东特有单倍型，推测如东和启东的遗传背景相似。基于Kimura双参数模型建立的NJ(图3)聚类图显示单倍型聚类并未完全展示地域性特色，但是对于某几个同一或者相近地理群体的单倍型具有聚类现象(如Hap09、Hap10、Hap14)。

7个微卫星标记共检测到54个等位基因，每个位点的等位基因数从5—10个不等，平均等位基因数为7.7个。在所有微卫星位点中，MM12736的等位基因数最多(10个)，Mm38的等位基因数最少(5个)(表1);朝鲜新义州和江苏如东、启东群体的平均等位基因数最多(Na= 7.7)，盘山群体的平均等位基因数最少(Na= 7.1);丹东群体的平均观测杂合度最高(Ho= 0.4750)，盘山群体的平均观测杂合度最低(Ho= 0.2964)。总体上，7个群体均具有较高的微卫星遗传多样性，7个群体平均等位基因数(Kruskal-Wallis test，P = 0.951)和观测杂合度(P=0.592)不存在显著差异。在49组群体位点组合中(7群体×7位点)，有18个组合由于杂合子缺失偏离HWE平衡(P＜0.05)。利用MICRO-CHECKER检验微卫星位点的无效等位基因概率，结果表明偏离HWE平衡的位点在不同群体中均存在无效等位基因，表现为杂合子缺失，但未检测到微卫星PCR扩增过程中易出现的“影子带”和大片段等位基因丢失现象。

2.2群体间遗传变异

文蛤7个群体COI序列的分子变异分析(AMOVA)结果见表4，群体间的遗传分化系数FST为0.28360(P＜0.05)，表明在整个遗传变异中群体间遗传变异占28.36％，群体内遗传变异占71.64％，群体内的遗传变异大于群体间，群体间发生显著的遗传分化(P＜0.05)。文蛤COI群体间FST的显著性检验结果见表5，两两群体间FST介于0.00714—0.45390之间，只有丹东和如东(FST=－0.00714)、新义州和盘山(FST= 0.01018)、启东和如东(FST=0.02529)、如东和丹东(FST=0.03713)的P值大于0.05，说明启东、丹东和如东之间，新义州、蛤蜊岗

文蛤线粒体COI单倍型网络图(图3)显示绝大部和盘山之间，东营和盘山之间未发生显著遗传分化。微卫星标记各群体间FST范围为0.01139—0.03935(表5)，经Bonferroni校正，各群体间均处于显著分化(P＜0.0083)。

图3　文蛤COI基因单倍型网络图(A)和NJ系统树(B)，外群毛蚶(Scapharca subcrenata)Genbank登录号AB729113Fig.3 The COI haplotype network and NJ tree for Meretrix meretrix，the GenBank accession number of outgroup Scapharca subcrenata is AB729113单倍型网络图反映的是单倍型之间的关系，每个圆圈代表一个单倍型，中间缺失的单倍型用黑圈表示，圆圈大小代表单倍型的出现频率，圆圈里的不同颜色代表不同的地理群体

表4　文蛤7个群体的COI序列遗传差异的分子方差分析(AMOVA)Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA)of mitochondrial cytochrome oxidase c subunit(COI)gene among seven populations of hard clam(Meretrix meretrix)

利用Mega构建7个群体遗传距离UPGMA树(图4)，7个群体聚类为两大分支，其中蛤蜊岗、盘山、新义州和东营聚为一大支，启东和如东相聚再与丹东群体聚为另一支。利用Geodis检测，未发现7个群体遗传距离与地理距离间的显著相关(r=0.4035，P=0.0600)，但去掉丹东群体后，检测到遗传距离与地理群体间的显著相关(r=0.7129，P=0.0280)。

表5　基于线粒体COI序列(成对FST，对角线下)和微卫星标记(成对FST，对角线上)的文蛤群体遗传分化Table 5 E stimates of population genetic differentiation based on microsatellite markers(pairwise FST，above diagonal)and mitochondrial cytochrome oxidase c subunit(COI)gene(pairwise FST，below diagonal)for the hard clam(Meretrix meretrix)

图4　文蛤7个地理群体的UMPGA系统树Fig.4 UMPGA tree constructed from genetic distance among 7 populations of hard clam，Meretrix meretrix

3　讨论

近年来，过度捕捞和环境恶化使我国近岸海域渔业资源量锐减，单纯依靠渔业资源自身补给已经不能修复受损的资源，增殖放流作为一种有效的资源修复手段，已经在世界各地得到推广和应用。放流苗种往往来源于养殖群体，随着放流数量的增加，人们越来越关注放流苗种的遗传多样性，以降低养殖群体污染野生种质资源的风险，对亲本和放流群体的遗传监测与管理已经成为评价增殖放流效果的指标之一［27］。已有研究表明，群体内遗传多样性降低会导致适应能力和生存能力降低［28］，对于经济物种，遗传多样性的降低会导致隐形有害基因表达增加和经济性状衰退，导致品种退化［29］。因此，利用DNA分子标记对放流群体进行遗传监测，研究放流群体与野生群体的遗传差异，对评估增殖放流效果具有重要意义。本研究利用线粒体COI和微卫星标记检测了文蛤7个地理群体的遗传多样性，两种分子标记的结果均显示江苏的如东和启东群体存在高的遗传多样性，这与文蛤地理种群的ISSR研究结果吻合，江苏文蛤ISSR的位点多态性(80.7％)高于辽宁文蛤的位点多态性(68.4％)［30］，说明江苏文蛤具有较强的遗传适应能力和选择育种潜力。

线粒体COI来源于通用引物扩增，可以用于物种间遗传多样性的横向比较。本研究检测到文蛤线粒体COI序列的单倍型多样性为0.763，核苷酸多样性为0.00239，与我国其他海水贝类同源序列［7，31-32］相比，具有较低的遗传多样性。本研究样品来源于我国主要的文蛤养殖海域，各群体的养殖规模大，但大群体不代表高遗传多样性，可能是由于贝类COI序列多样性具有种属特异性决定的。此外，对各群体Hardy-Weinberg检验结果表明，各群体均表现一定的杂合子缺失，可能是有效群体小、近交和群体亲本性别比例失衡等因素［33］造成，从而导致文蛤群体COI遗传多样性偏低。由于早期的文蛤养殖缺乏科学性指导，采取“野捕家养”供苗系统，没有充分考虑有效群体数量和利用杂种优势进行人工育种，稀有等位基因很可能在大规模人工育苗情况下丢失而导致Hardy-Weinberg失衡。

微卫星的杂合度和等位基因数是反映群体遗传多样性的重要参数。本研究中文蛤群体平均观测和期望杂合度分别为0.2964—0.4750和0.7413—0.8228，但7个群体之间的差异不显著。各群体不同位点的杂合度也没有明显差异，说明各群体遗传多样性的差别不大。从等位基因数来看，每个位点的等位基因数为5—10个，而各群体平均等位基因数从7.1到7.7个不等，差异亦不显著，这与杂合度的检测结果基本一致。而从COI单倍型网络图来看，各群体单倍型数量从3到13个不等，群体间差异明显，与等位基因数和杂合度结果不一致，这可能是因为线粒体DNA属于母系遗传和单倍体的特性，与核遗传DNA相比拥有更小的有效群体，更容易受瓶颈效应影响［9］。

群体遗传分化指数FST是反映群体间遗传分化程度的重要指数。赫崇波等［3］研究辽宁和山东沿海5个文蛤群体遗传多样性，AFLP的分析得到的FST值为0.0596，结果表明群体间相似性较大，本研究中7个文蛤群体的FST值为0.28360，群体间发生显著的遗传分化，与本研究中文蛤取样地理范围广有关，这正好和Geodis的结果遗传距离和地理距离显著相关(丹东群体除外)相符。从系统进化树来看，丹东群体与江苏的2个群体聚为一类，暗示江苏苗种的异地养殖已经污染丹东文蛤的遗传背景。从分子遗传学角度来看，文蛤远距离异地养殖或者增殖放流可能对当地野生群体的遗传结构造成影响，因此，文蛤增殖放流应尽量“就地取材，避免异地文蛤种质资源污染当地文蛤。在选用优良苗种的同时，应适当提高放流亲本数量，提高有效群体数量，避免放流群体遗传多样性降低和遗传结构改变，并制定科学合理的遗传多样性监测方案，以确保增殖放流科学合理开展。

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Genetic diversity and differentiation of seven geographical populations of hard clam(Meretrix meretrix)assessed by COI and microsatellite markers

LI Hongjun1，ZHANG Jingjing1，2，YUAN Xiutang1，*，ZHANG Anguo3，LIU Guize1，SHAO Kuishuang1，WANG Lijun1
1 National Marine Environmental Monitoring Center，Dalian 116023，China
2 Dalian Ocean University，Dalian 116023，China
3 Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China

Abstract:The hard clam(Meretrix meretrix)is a commercially important shellfish in China.With the rapid development of the aquaculture industry of M.meretrix，the demand for seed cultures has led to the over-exploitation of natural populations，which makes stock enhancement a high priority.Stock enhancement programs that use a small number of breeders for the production of hatchery-reared juveniles to be released to the environment may have negative effects on the genetic diversitybook=575,ebook=303of wild populations due to a reduction in the genetic variability of the released stock.In this study，the genetic diversity of seven geographical populations(Sinuiju in North Korea; Dandong，Geligang，and Panshan in Liaoning Province; Dongying in Shandong Province; and Rudong and Qidong in Jiangsu Province)of M.meretrix was assessed using the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I(COI)gene and microsatellite markers.We obtained a total of 142 COI sequences.Each COI sequence was 602 bp in length.These sequences contained 14 variant sites，including 12 transitions and 2 transversions.Twenty-two haplotypes were identified，with 12 haplotypes shared among populations.Population-specific haplotypes were identified in the Sinuiju，Dandong，and Qidong population，respectively.The haplotype diversity was highest in Rudong(h=0.900)and lowest in Dongying(h=0.600).The nucleotide diversity was highest in Dandong(π= 0.00350)and lowest in Geligang(π= 0.00115).Neutral test(Fu's Fs)and mismatch distribution analysis revealed that the hard clam experienced a population expansion event.Analysis of molecular variance(AMOVA)indicated that 71.64％ of the genetic variance was within populations and 28.36％ of the variance was among populations，demonstrating significant genetic differentiation among populations(P＜0.05).A total of 54 alleles were amplified from 280 individuals by using 7 microsatellite markers，with an average of 7.7 alleles per locus.The mean observed heterozygosity(Ho)and expected heterozygosity(He)was 0.387 and 0.7996，respectively.Compared with other populations，genetic diversity in the Jiangsu population was highest，but the difference was not significant(Kruskal-Wallis test，P＞0.05).Among the 49 populationlocus combinations(7 populations×7 loci)，18 cases deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium(P＜0.05)，indicating heterozygote deficiencies.The neighbor-joining tree showed that the haplotypes were not clustered according to geographical location，but some haplotypes from the same or neighboring locations grouped together(e.g.Rudong and Qidong showing geographical clustering).The unweighted pair group with arithmetic mean(UPGMA)phylogenetic tree showed that the Dandong population was grouped with the Jiangsu population，suggesting that the introduced Jiangsu clam seed has contaminated the genetic background of the Dandong population.These results highlight the need to monitor the genetic effects of releasing large numbers of juveniles.

Key Words:Meretrix meretrix; population genetic variation; COI; microsatellite; stock enhancement

*通讯作者

Corresponding author.E-mail: xtyuan@ nmemc.org.cn

收稿日期:2014-09-15;

修订日期:2015-07-27

基金项目:国家海洋公益项目(201305043，201305027);国家自然科学基金项目(31101899)

DOI:10.5846/stxb201409151822