头穴丛刺对AD大鼠神经细胞凋亡的影响

李虹霖，徐　飞，夏昆鹏，张　淼，王玉珏*

(.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001；2.黑龙江省医院，哈尔滨 150001)



头穴丛刺对AD大鼠神经细胞凋亡的影响

李虹霖1，徐飞2，夏昆鹏1，张淼1，王玉珏1*

(.黑龙江中医药大学附属第二医院，哈尔滨 150001；2.黑龙江省医院，哈尔滨 150001)

摘要：目的观察头穴丛刺对阿尔茨海默病(AD)大鼠神经细胞凋亡的影响。方法48只清洁级Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组、对照组各12只。采用Aβ1-42寡聚体进行造模，造模成功后，治疗组采用头穴丛刺治疗，对照组采用传统头针治疗，模型组与假手术组不进行任何手段干预。1次/d，6 d为1个疗程，间隔1 d，治疗4个疗程后，通过免疫组化方法测定海马区bcl-2、bax、caspase-3表达的变化。结果治疗组、对照组海马区bax、caspase-3表达较模型组均显著下降(P<0.01),治疗组表达低于对照组(P<0.05),bcl-2阳性神经元计数较模型组显著升高(P<0.01),治疗组表达高于对照组(P<0.05)。结论头穴丛刺能有效抑制AD大鼠海马区神经细胞凋亡进而提高认知水平。

关键词：阿尔茨海默病；针灸疗法；头穴丛刺；神经细胞凋亡

阿尔茨海默病(AD)又称老年性痴呆[1]，是一种大脑原发性神经退行性病变[2]，多于早老期发病[3]。主要以近记忆功能障碍为首要临床表现,继而出现学习能力减退、判断力下降、言语障碍及运动障碍等[4]。对于本病的发病机制目前仍不甚明确，中医学认为其与气滞、痰阻有关[5]。随着世界人口步入老龄化社会，AD的发病率也逐年上升[6]，流行病学调查[7]显示，我国超过60岁老人AD的发病率为4.2%，家庭及社会承受日渐加重的负担，因此对AD治疗方法的研究已成为热门课题。本实验采用免疫组织化学染色方法,研究头穴丛刺对Aβ1-42所致AD模型大鼠海马神经细胞凋亡相关因子表达的影响,为进一步阐明头穴丛刺对AD模型大鼠神经细胞保护性作用及机制提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物分组清洁级Wistar大鼠48只，体质量250～300 g，普通环境喂养。将其随机分为4组:假手术组、模型组、对照组、治疗组，每组各12只。

1.2模型制备参照大鼠脑立体定位图谱,给大鼠称重，大鼠深麻醉以10%水合氯醛由腹腔给药。用脑立体定位仪固定大鼠，取平颅头位。大鼠头部皮肤用乙醇进行消毒，手术刀剃毛，将皮肤剪开，仔细除去硬脑膜(过氧化氢法剔除)。以囱门、右侧前囟向后3 mm、中线向右旁开2 mm定位海马背侧部，其深度为颅骨下2.9 mm。钻孔后将Aβ1-42溶液通过微量进样器注入海马区，用时5 min结束注射，5 min后出针以保障溶液扩散完全。出针后局部常规消毒，缝合，连续进行3 d的青霉素治疗，防止感染。假手术组仅向CA1区注射等量生理盐水，手术操作过程同前。

1.3分组处理治疗组：采用于志顺教授头部腧穴七区划分法[8]，取顶区(百会穴及左、右旁开5 mm)、顶前区(前顶穴及左、右旁开5 mm)、额区(神庭穴及左、右旁开5 mm)，常规剪毛消毒。以毫针(规格：0.35 mm×15 mm)平刺，深度为5mm，行1 min快速捻转手法后留针2 h，期间每30 min 快速捻转1次，1次/d，6 d为1个疗程，间隔1 d，治疗4个疗程。对照组：取百会、四神聪，沿皮分别刺入2 mm，采用平补平泻手法，快速捻转1 min 后留针2 h。1次/d，6 d为1个疗程，间隔1 d，治疗4个疗程。假手术组、模型组：每日同一时间段以相同手法进行抓取和固定，但不进行任何治疗干预。

1.4 指标测定

1.4.1取材与切片大鼠以10%水合氯醛(40 mg/100 g)腹腔注射麻醉，经心升主动脉插管，先后用生理盐水、4 ℃、冲洗和灌注、取脑。从脑内注射点前0.5 mm处冠状位切开，由冠状位向前切取厚约4 mm的脑块，4 ℃、4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定过夜。常规石腊包埋，连续切片，片厚4 μm。

1.4.2免疫组化SP法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3石蜡切片常规脱腊后置于3%H2O2去离子水中进行10 min孵育；室温条件下正常山羊血清孵育10 min；一抗分别滴加兔抗鼠 Bcl-2、Bax、Caspase-3 多克隆抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜；生物素标记37 ℃条件下孵育10 min；辣根酶标记链酶卵白素工作液37 ℃条件下孵育10 min；DAB显色，清水冲洗终止反应；苏木精复染，脱水，透明，中性树脂封片。PBS代替一抗做阴性对照，其余操作相同。每组随机选取5张切片进行观察，每张切片在高倍镜下随机取4个4 mm视野，对视野中阳性细胞数进行计数，相加后取各组平均值。

2结果

各组大鼠海马区bcl-2、bax、caspase-3阳性细胞数变化，见表1。

mm2

注：与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与对照组比较，▲P<0.05

3讨论

本实验采用头穴丛刺疗法，以于志顺教授通过长年临床及实验研究总结提出“针场”[8]为理论依据，选取头针七区中的顶区、顶前区及额区等映射学习记忆能力、认知功能及人格障碍的代表区[9]，通过大量临床观察证明头穴丛刺能改善AD患者学习记忆，疗效确切[10]。以此为临床基础，通过实验室研究进一步探讨头穴丛刺改善AD患者学习记忆能力的作用机制。

学习记忆以神经元作为物质基础[11]，研究[12]显示，神经元的丢失与AD认知能力下降之间关系密切，AD脑内的神经元的丢失机制主要与细胞凋亡有关[13]。细胞凋亡具有非常复杂的发生机制，受多种凋亡促进或抑制因素的影响。Bcl-2蛋白为抗凋亡蛋白之一，其超表达可抑制细胞凋亡的发生，而Bax蛋白在Bcl-2家族中属于前凋亡蛋白，其作用为促进细胞凋亡的发生[14-15]，capase-3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在细胞凋亡过程中起至关重要的作用[16]。死亡因子激动下使bax转移至线粒体膜上，促使促凋亡因子cyt-c的释放，使capase-3得以激活，进而启动capase级联反应导致细胞凋亡的进行；而超表达的bcl-2可抑制bax转位的发生，从而阻断细胞凋亡进程[17]。研究[18]显示，AD病人脑中bcl-2蛋白明显的下调、bax及capase-3蛋白表达上调。本研究结果表明，头穴丛刺可上调bcl-2表达、下调bax及capase-3的表达，从而改善AD大鼠行为认知能力。

参考文献：

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Cluster needling of scalp point therapy on neuron apoptosis of Alzheimer’s disease rats

LI Honglin1,XU Fei2,XIA Kunpeng1,ZHANG Miao1,WANG Yujue1*,

(1.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150001,China;2.Heilongjiang Provincial Hospital,Harbin 150001,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp point therapy on neuron apoptosis of Alzheimer’s disease rats.MethodsForty eight wistar rats were randomized into four groups including model group,sham operation group,observation group and control group.Establish model with Alzheimer’s disease by injecting Aβ1-42oligomer into bilateral hippocampus.After successful modeling,the observation group was intervened by cluster needling of scalp point,the control group only received traditional needling of scalp,and the model group and the sham operation group took no treatment.All rats were treated once a day.One course of treatment was comprised of six days and one day interval.After four courses of treatment,observe the changes of bcl-2,bax and caspase-3 by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the expression of bax and caspase-3 of the observation group and the control group decreased significantly (P<0.01).While,there was a lower expression in the observation group than in the control group (P<0.05).Compared with the model group,the expression of bcl-2 of the observation group and the control group increased significantly (P<0.01).While,there was a higher expression in the observation group than in the control group (P<0.05).ConclusionThe cluster needling of scalp point therapy could improve cognitive level by effectively inhibiting neuron apoptosis in hippocampus area of Alzheimer’s disease rats.

Keywords：Alzheimer’s disease;acupuncture therapy;cluster needling of scalp point therapy;neuron apoptosis

(收稿日期:2015-08-26)

文章编号：2095-6258(2016)02-0245-03

中图分类号：R246.1

文献标志码：A

*通信作者：王玉珏，电话-13936262644，电子信箱-wangyujue201314@126.com

作者简介：李虹霖(1981-)，女，在站博士后，副主任医师，主要从事针灸康复治疗神经系统疾病。

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目(H201476);黑龙江省博士后流动站资助基金“头穴丛刺对Aβ1-40致AD大鼠MAPK级联信号通路影响的研究”(LBH-Z14199)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.008