补肺益肾方对幼龄哮喘豚鼠模型IL-5信号通路的调控机制

王明明

(南京中医药大学第一临床医学院，南京 210029)



·实验研究·

补肺益肾方对幼龄哮喘豚鼠模型IL-5信号通路的调控机制

王明明

(南京中医药大学第一临床医学院，南京 210029)

摘要：目的观察中药补肺益肾方对幼龄哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中白介素-5(IL-5)水平以及嗜酸粒细胞(EOS)上白介素-5受体α(IL-5 R α) mRNA表达的影响，探讨中药补肺益肾方通过IL-5信号通路促进哮喘EOS凋亡的机制。方法24只健康幼龄豚鼠随机分为正常组、模型组、中药组。以卵蛋白致敏激发制备豚鼠哮喘模型，分离豚鼠BALF中的EOS，酶联免疫吸附法(ELISA)检测BALF中IL-5的含量，TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测EOS凋亡，原位杂交检测IL-5 RαmRNA表达。结果模型组IL-5水平高于正常组(P<0.01)，中药组IL-5水平低于模型组(P<0.05)。模型组豚鼠EOS凋亡明显减少，中药组EOS凋亡明显高于模型组(P<0.01)。模型组豚鼠EOS表达IL-5 Rα mRNA明显低于正常组(P<0.01)，中药组EOS表达 IL-5 RαmRNA明显增加(P<0.05)。结论中药补肺益肾方可通过降低气道IL-5水平，促进IL-5 RαmRNA表达，来促进EOS凋亡，减轻气道炎症，从而达到防治哮喘的目的。

关键词：补肺益肾；哮喘；嗜酸粒细胞；白介素

哮喘是一种慢性炎症性疾病[1]，EOS是哮喘发病机制中的一种重要炎症细胞[2]，EOS募集于肺中并释放炎性介质是哮喘气道炎症的关键环节之一[3]，IL-5则是EOS成熟、内皮黏附、活化等过程中的关键细胞因子[4]，是促进哮喘气道炎症形成和发展的重要细胞因子[5]。中医补肺益肾防治小儿哮喘疗效肯定，本研究通过观察中药补肺益肾方对幼龄哮喘豚鼠IL-5水平、IL-5 Rα mRNA表达和EOS凋亡的影响，探讨其通过IL-5信号通路途径防治哮喘的机制。

1材料

1.1动物普通级健康纯白豚鼠24只，21～30日龄，雄性，体质量(190±20)g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，实验动物合格证号：SYXK(苏)2005-0009。

1.2药物补肺益肾方由黄芪、白术、防风、紫河车等组成。补肺益肾方制备：将以上中药(按处方配伍用量配制好，购自安徽亳州市华龙中药饮片厂)浸水 2 h，煮沸再用文火煎40 min，过滤后药渣再次加水文火煎，重复3次，合并煎煮液，经水浴浓缩，使终浓度相当于每1 mL生药2.5 g。1.3试剂与仪器卵蛋白(上海伯奥生物科技有限公司)；Percoll细胞分离液(瑞典Pharmacia公司)；多聚赖氨酸(福州迈新生物技术开发有限公司)；DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；豚鼠IL-5检测试剂盒(美国ADL公司)；IL-5 R原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；S-888E型超声波雾化器(中外合资南京道芬电子有限公司)；LD25-2低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂产品)；OLYMPUS荧光多功能显微镜(日本OLYMPUS公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；美国IPP图象分析软件(美国Media Cybernetics 公司)。

2方法

2.1分组与模型制备24只健康豚鼠随机分为3组，每组8只：正常对照组，简称正常组；哮喘模型对照组，简称模型组；补肺益肾方口服组，简称中药组。按国际上常用的方法[6]，以卵蛋白致敏和攻击加以复制。在实验的第1天，除正常组外各组豚鼠腹腔注射10%卵蛋白1 mL致敏；第15天将致敏的豚鼠置于密闭有机玻璃罩内，给予含1%卵蛋白的生理盐水超声雾化吸入诱喘，直至哮喘发作，即为造模成功。此后，每周诱喘2次，使哮喘反复发作。正常组在实验的第1天以1 mL生理盐水进行腹腔注射，第15天予超声雾化等容积的生理盐水，此后每周超声雾化等容积的生理盐水2次。

2.2干预方法实验第16天，即第1次诱喘次日始治疗，中药组以补肺益肾方(9.2 g/kg)灌胃，2次/d，疗程2周，最后1次诱喘前12 h停止治疗。正常组和模型组均不治疗。

2.3观察指标及方法

2.3.1支气管肺泡灌洗实验第29天，给予各组豚鼠最后1次诱喘，于24 h后腹腔内注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，麻醉成功后将其固定于操作台上，沿颈正中线剪开皮肤，分离气管，剪一切口行气管插管，然后用4 ℃RPMI-1640培养液5 mL从气管注入，共3次，轻轻按摩豚鼠胸部20～30 s后缓慢回抽，回收后的肺泡灌洗液1 300 r/min,20 min离心，上清液-20 ℃保存，用于检测IL-5，沉淀细胞用1 mL PBS重新悬浮，等待分离嗜酸性粒细胞。

2.3.2嗜酸性细胞分离按文献[7]配制不同密度的细胞分离液。在离心管中依次加入1.100、1.085的Percoll液各1 mL，最后加入上述细胞悬液1 mL，用2 000 r/min ，20 min，20 ℃离心。回收取2种密度Percoll液介面之间的EOS，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，将EOS涂在预先用多聚赖氨酸黏附剂处理过的玻片上，4%多聚甲醛固定30 min。

2.3.3ELISA法IL-5水平检测参照试剂盒说明书进行操作。

2.3.4IL-5 R原位杂交检测参照试剂盒说明书进行操作。细胞胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞，光镜下观察IL-5 R α mRNA表达阳性细胞，每张涂片在高倍视野下随机选择5个视野，计数200个细胞以上，计数各组表达阳性细胞百分比。

2.3.5TUNEL法原位细胞凋亡检测参照试剂盒说明书进行操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性凋亡细胞，光镜下观察阳性凋亡细胞，每张涂片在高倍视野下随机选择5个视野，计数200个细胞以上，计数总细胞数和凋亡细胞数，根据以下公式计算细胞凋亡率。凋亡细胞阳性率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

3 结果

3.1对各组豚鼠BALF中IL-5的影响见表1。

表1　各组豚鼠BALF中IL-5水平　pg/mL

注：与正常组比较,#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较,△P<0.05

3.2对各组豚鼠BALF中EOS IL-5 RαmRNA表达的影响见表2。

表2　各组豚鼠BALF中EOS IL-5 RαmRNA表达水平

注：与正常组比较,#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较,△P<0.05

3.3对各组豚鼠BALF中EOS凋亡的影响见表3。

表3　各组豚鼠BALF中EOS 凋亡水平

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，△△P<0.01

4讨论

EOS浸润是哮喘过敏性炎症的病理特征[8]，是气道炎症的中心环节[9]，能够反映支气管哮喘患儿的气道炎症程度[10]，哮喘的严重程度取决于EOS在呼吸道内的浸润与活化[11]，其他哮喘病程中的炎性细胞最终通过EOS而产生效应，炎性细胞凋亡可与炎症反应消退有关[12-13]。IL-5由Th2细胞分泌[14]，是形成嗜酸性粒细胞炎症的关键细胞因子[15]，能够与EOS表面受体结合，对EOS的分化、成熟、黏附、浸润、凋亡有独特作用[16]。气道中的EOS来源于外周血和嗜酸粒细胞前体祖细胞，嗜酸粒细胞前体祖细胞在骨髓生成[17]，细胞表面表达IL-5Rα，气道炎症时嗜酸粒细胞前体祖细胞由于致敏原的刺激通过细胞表面eotaxin受体CCR3的作用从骨髓迁移到气道中，并在IL-5的作用下分化成熟为成熟EOS并直接被激活[18]。因此IL-5可将EOS募集和迁移入呼吸道并对维持炎症反应具有正向调控作用[19]，而募集至气道的EOS又能分泌IL-5，如此恶性循环，导致了气道的慢性炎症，所以IL-5成为调节EOS介导的哮喘炎症反应的重要靶点[20]。而EOS膜表面有IL-5的受体，IL-5受体α链转录调节能产生可溶型α受体，可溶型α受体分泌至体液中与IL-5结合，就可阻滞IL-5对EOS的活化，起到负性调节剂的作用，从而降低了IL-5的生物学作用[21]。

本实验结果显示，应用中药补肺益肾方后哮喘豚鼠肺内IL-5含量减少，EOS表达IL-5可溶性受体增加，减弱IL-5生物学功能，这两者都可影响EOS活性，使EOS凋亡加速，有利于肺内EOS清除，减轻气道炎症。

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Regulating mechanism of traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney on IL-5 signal pathway of young guinea pigs with asthma

WANG Mingming

(First Clinical Medical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of the traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney on interleukin-5 level and expression of IL-5 receptor α mRNA in eosinophils (EOS) of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)of young guinea pigs with asthma and to explore the mechanism of the traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney in promoting eosinophil apoptosis by IL-5 signal pathway.MethodsThe 24 young guinea pigs were divided into three groups randomly,normal control group,model group and the traditional Chinese medicine group.Asthma model of guinea pigs were sensitized by ovalbumin.EOS was purified from BALF.The content of IL-5 in BALF was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Apoptosis was detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Expressions of IL-5 IL-5Rα mRNA were measured by bridization.ResultsThe content of IL-5 in model group was higher than that of normal group(P<0.01),while the content of IL-5 in the traditional Chinese medicine group was lower than that of model group(P<0.05).EOS apoptosis in model group guinea pig were significantly decreased,while EOS apoptosis in the traditional Chinese medicine group guinea pig were higher than that of model group(P<0.01).Expressions of IL-5Rα mRNA in EOS from model group were remarkably lower than that of normal group(P<0.01),while expressions of IL-5 R α mRNA in EOS from the traditional Chinese medicine group were increased(P<0.05).ConclusionThe traditional Chinese medicine of invigorating lung and nourishing kidney promotes eosinophil apoptosis by decreasing the content of IL-5 in airway and increasing expressions of IL-5 R α mRNA.So it can relieve airway inflammation and prevent asthma.

Keywords：invigorate lung and nourish kidney;asthma;eosinophil;interleukin

(收稿日期:2015-08-10)

文章编号：2095-6258(2016)02-0234-04

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

作者简介：王明明(1968-)，女，博士，副教授，副主任中医师，主要从事小儿肺系疾病研究。

基金项目：江苏省高校自然科学基础研究项目(07KJB360089)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.005