白腐菌产漆酶活化木粉制备纤维板的力学性能1)

郁昭轩　王丽茹　康兆颜　韩松

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

周永鑫　　　　　　　朱晓冬　陈广胜

(延边林业集团科技产业处)　　　(生物质材料科学与技术教育部重点实验室(东北林业大学))



白腐菌产漆酶活化木粉制备纤维板的力学性能1)

郁昭轩王丽茹康兆颜韩松

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

周永鑫朱晓冬陈广胜

(延边林业集团科技产业处)(生物质材料科学与技术教育部重点实验室(东北林业大学))

摘要利用白腐菌产漆酶的特性，优化连续培养高活漆酶，使得大量培养漆酶成为可能。结果表明：在连续培养和直接培养两种情况下，第11天时漆酶的酶活最高；利用连续培养白腐菌得到的大量的粗漆酶来处理木粉，活化其木质素成分，使其能够替代一部分的脲醛树脂胶制备纤维板。静曲强度上升了18.95%，弹性模量上升了35.49%，内结合强度上升了44.11%。漆酶催化氧化了木质素，增加了木质纤维中化学键的数量，使木质纤维之间的胶结点增多。与此同时，经过漆酶处理的木粉增强了脲醛树脂胶黏剂在纤维表面的渗透和扩散能力，提高了纤维板的力学性能。

关键词白腐菌；漆酶；纤维板；力学性能

分类号TS653.5

Mechanical Properties of the Fiberboard from Production of Laccase from White Rot Fungus

Yu Zhaoxuan, Wang Liru, Kang Zhaoyan, Han Song

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Zhou Yongxin(Science and technology industry of Yanbian Forestry Group); Zhu Xiaodong, Chen Guangsheng(Key Laboratory of Bio-Based Material Science & Technology of Ministry of Education, Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：86-89.

By using the characteristics of white rot fungus, we produced laccase, optimized the continuous culture of high activity laccase, and cultivated a large number of laccase. The eleventh day culture showed the highest laccase activity by continuous culture and direct culture methods. Enzyme treatment process can produce environmental protection board, which can solve the problem of formaldehyde pollution caused by indoor decoration. The properties of static bending strength, elastic modulus and interior bond strength were increased by 18.95%, 35.49% and 44.11%, respectively. The laccase catalyzed oxidation of lignin, and increased the number of chemical bonds in the fiber so that the bonding points between the wood fibers increased. Wood flour treated by the laccase enhanced urea formaldehyde resin adhesive in fiber surface penetration and diffusion capacity that increased mechanical property of the fiberboard.

KeywordsWhite rot fungus; Laccase; Fiber board; Mechanical property

人造板释放的游离甲醛造成的室内环境污染问题是近年来人们关注的焦点[1-3]。游离甲醛大多集中在人造板原材料的胶黏剂中，因此在人造板生产过程中采用无胶胶合或者对胶黏剂配方进行改进成为解决这一问题的突破口[4-6]。目前无胶胶合的方法主要有以下几种：氧化结合法、自由基引发法、酸催化缩聚法、碱溶液活化法、天然物质转化法和酶处理法[7-8]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，可利用活性中心的铜离子催化氧化多种结构的芳香化合物，同时将分子氧还原成水[9]。利用漆酶催化活化可以使木材自身组分产生胶合作用，或者利用漆酶催化活化工业木质素生成一种与酚类化合物相似的胶黏剂，使得在人造板生产工艺中实现无胶胶合成为可能，为解决游离甲醛污染问题提供了可行的方法。国内外研究人员用漆酶处理法进行试验已取得一定的研究成果。Kharazipour等将纤维放置在温度为25 ℃漆酶水溶液中,经2～7 d培养后，烘干到含水率3%左右热压成纤维板，与对照板相比内结合强度得到了一定的提高[10]。Yamaguchi等用漆酶处理纤维，得到了内结合强度和静曲强度都有了很大提高的中密度纤维板[11]。Febly等用漆酶活化山毛榉木纤维，得到的中密度纤维板力学性能要优于普通纤维板[12]。曹永健以枫香、思茅松纤维、漆酶和工业木质素及其磺酸盐为主要原料，用漆酶处理木纤维压制纤维板，结果表明漆酶处理使纤维板的密度、吸水厚度膨胀率、内结合强度均有一定程度的提高[12]。周冠武提出漆酶催化氧化杨树木纤维的可能反应机制，结果表明漆酶介导反应不能直接触及木质素的大部分结构域，因此低分子量可溶性木质素可能重新附着到纤维表面，起着与胶黏剂类似的活性化合物的作用[13]。李振坤采用漆酶催化工业碱木质素的方法，制备了可再生和环保的生物质基漆酶/木质素胶黏剂，并对漆酶催化木质素的胶合机理进行了研究[14]。以上研究结果表明，用漆酶处理木纤维制成的纤维板可以提高产品的力学性能，但是大部分研究采用的都是商品漆酶，在生产中的成本较高，且产量不高。

漆酶在自然界分布十分广泛，在很多植物、真菌和细菌的分泌物中均能找到漆酶[15-18]。白腐菌是一种丝状真菌，在营养丰富的培养基上生长很快，具有发达的菌丝体，经过适当的工艺处理可以连续产出漆酶[19-20]。本研究针对白腐菌产漆酶的特性优化培养高活漆酶，并且利用连续培养的技术，使得大量培养漆酶成为可能，从而进一步降低漆酶的生产成本，以替代传统的高昂的商品漆酶。然后，利用培养白腐菌得到的大量的粗漆酶来处理木粉，通过活化木质素，使其替代一部分脲醛树脂胶黏剂以制造低甲醛释放、产品力学性能高于普通纤维板的高性能人造板材。

1材料和方法

1.1材料

本实验中培养的白腐菌的菌种为糙皮侧耳菌。糙皮侧耳菌相对于其他菌种优势在于更易培养，且生产酶活相对较高。脲醛树脂胶采用市场购买的粉末状固体脲醛树脂胶(东莞市统耐树脂有限公司生产的，M-101A型)，外观为白色，黏度为2 500～3 500 MPa·s，25 ℃时m(胶)∶m(水)=2∶1，pH值为7.5，密度为1.22 g/cm3，细度为90%过80目筛。木粉采用市场购买的杨木木粉，目数为80目，产自黑龙江省绥化市双丰林业局。木质纤维原料采用市场上购买的柞木和杨木混合纤维，纤维的含水率为8%。

1.2白腐菌的优化培养

本实验选用的培养方法为模拟自然法[21]，即向培养基中添加天然物质，模拟白腐菌生长的自然环境进行白腐菌的培养。实验分为两个培养基阶段，其过程为：将白腐菌菌种放置在25 ℃的恒温培养箱里进行活化，活化后接种在固体培养基上，在仪器温度范围为25～28 ℃的条件下恒温培养。至白腐菌菌落长满平板后，接种到液体培养基中，在仪器温度范围为25～28 ℃的条件下进行恒温摇床培养，在摇床培养过程中，白腐菌生产漆酶。

1.3白腐菌的连续培养

在实验过程中，由于对漆酶的需求量较大，且由于模拟自然法的常规培养方法培养的白腐菌需要较长的周期，并且有着染菌等一系列的问题，故如何在较短的时间内培养出大量且产漆酶酶活较高的白腐菌成为重点和难点。连续培养的过程就是当培养的第一批白腐菌酶活达到最高值时，将酶液滤出加入新的培养液，并按照优化培养的方法继续培养。

1.4木粉和木质纤维的活化处理

将木粉和木质纤维原料分别与活化处理5 d的漆酶液进行混合。木粉、木纤维与漆酶液的配比混合比例均为m(木粉、木纤维)∶m(漆酶)=1∶2，将混合物搅拌均匀，放置在25～30 ℃的环境下静置7 d。静置期间隔天搅拌混合物，使混合物中漆酶与木质素及氧气充分接触达到活化的效果。活化处理后的木粉、木质纤维静置后进行烘干，将木粉和木质纤维烘至含水率为8%～10%，即气干状态待用。烘箱温度设置在50 ℃，温度达到50 ℃以上时，漆酶会失去活性。

1.5纤维板制作

将市场购置的脲醛树脂胶黏剂与漆酶处理后的木粉以一定比例进行混合。漆酶活化后的木粉在热压反应中其表面官能团会发生反应，起到胶合作用，因此在本研究中用其替代一部分脲醛树脂胶黏剂以达到胶合和降低成本的作用。实验中采用的混合比例分别是：A为m(脲醛树脂)∶m(木粉)=9∶1、B为m(脲醛树脂)∶m(木粉)=6∶4、C为m(脲醛树脂)∶m(木粉)=3∶7。二者混合后以施胶量为12%的比例与漆酶活化后的木质纤维进行铺装，热压制成纤维板。热压温度为120 ℃，热压时间为30 min，厚度为6 mm。在同样的热压条件下，使用不加入木粉的脲醛树脂胶对漆酶活化后的木质纤维进行施胶，施胶量为12%，厚度为6 mm。

1.6纤维板性能测试

纤维板制作后放置在恒温恒湿室中48 h，然后按照GB/T 11718—2009，釆用万能力学实验机测定其静曲强度、弹性模量和内结合强度。按照GB/T 17657—2013中的穿孔萃取法测试试件的甲醛释放量。采用日本理学公司生产的D/MAX2200X射线衍射仪测定木质纤维素的相对结晶度，扫描范围为5°～40°，扫描速度为4°/min。

2结果与分析

2.1漆酶活性测试

利用漆酶氧化ABTS(2,2＇-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))，在可见紫外分光光度计测定波长为420 nm处0～15 s内吸光度值随时间的变化规律，求得漆酶氧化ABTS反应速率，进而推算酶活(见表1)。可以看到连续培养漆酶的酶活在前5 d的增速较快，到第5天就达到较高的酶活值。连续培养缩短了培养周期，可在相对较短时间得到大量高活漆酶。在连续培养和直接培养两种情况下，第11天时漆酶的酶活最高。

表1　直接培养和连续培养的酶活测试结果

2.2纤维结晶度

采用X射线衍射仪测定不同培养时间漆酶处理木粉的相对结晶度。漆酶未处理木粉和漆酶培养3、5、7、9、11 d的木粉相对结晶度分别为55.32%、61.28%、64.36%、65.53%、65.79%、68.73%。从测试结果可以看出漆酶培养11 d的相对结晶度比漆酶未处理木粉高24.24%，比漆酶培养3 d木粉高12.15%。这是由于漆酶催化氧化了木质素，提高了纤维素上羟基分子间和分子内结合的可能，增加了木质纤维中化学键的数量，使木质纤维之间的胶结点增多。漆酶活化木粉相对结晶度的增加预示纤维板力学性能指标的提高。

2.3漆酶处理纤维板与素板物理力学性能对比

首先，观察漆酶处理纤维板与素板的外观质量，不同条件下制备的纤维板均没有分层和鼓泡质量缺陷。但是，随着脲醛树脂和木粉混合比例的变化，特别是当混合比例为C时，纤维板试件的板边开始变得松软。总体来说试件均符合国家标准GB/T 11718—2009中规定的合格品的外观质量要求。漆酶处理纤维板与素板的物理力学性能如表2所示。

表2　漆酶处理纤维板与素板的物理力学性能测试结果

2.3.1静曲强度

混合比例为A时压制的纤维板的静曲强度平均值为17.57 MPa，而素板的静曲强度平均值为14.24 MPa，漆酶处理板的静曲强度比素板上升了18.95%。但是随着漆酶处理木粉比例的增大，静曲强度经过初期的上升后开始下降，当混合比例为C时，试件的的静曲强度平均值仅为3.76 MPa，远低于素板的平均值。采用少量的漆酶处理木粉和脲醛树脂胶黏剂混合制备纤维板时，经过漆酶处理的木粉增强了脲醛树脂胶黏剂在纤维表面的渗透和扩散能力，漆酶的作用明显。与此同时，漆酶催化氧化了木质素，增加了纤维中化学键的数量，使木质纤维之间的胶结点增多，提高了最终纤维板的胶合性能。但是，随着漆酶处理木粉添加量的提高，木粉对胶合性能的影响超过了漆酶的影响，木粉本身阻碍了木质纤维之间的胶合，从而影响了纤维板的力学强度。

2.3.2弹性模量

经漆酶处理的混合比例为A时压制的纤维板的弹性模量平均值为1 586.30 MPa，而素板的弹性模量平均值为1 023.29 MPa，漆酶处理板的弹性模量比素板上升了35.49%。但是随着漆酶处理木粉比例的增大，弹性模量经过初期的上升后开始下降；当混合比例为C时，试件的静曲强度平均值仅为368.45 MPa，远低于素板的平均值。

2.3.3内结合强度

经漆酶处理的混合比例为A时压制的纤维板的内结合强度平均值为0.34 MPa，而素板的内结合强度平均值为0.19 MPa，漆酶处理板的内结合强度比素板上升了44.11%。但是随着漆酶处理木粉比例的增大，内结合强度经过初期的上升后开始下降；当混合比例为C时，试件的的内结合强度平均值仅为0.07 MPa，远低于素板的平均值。

2.3.4甲醛释放量

经漆酶处理过的木粉制备的纤维板甲醛释放量均低于素板的甲醛释放量，小于90 μg/g，达到了国家标准中规定的E1级标准。当混合比例为C时，纤维板试件的甲醛释放量平均值为57.9 μg/g，比素板的甲醛释放量降低了30.8%。

3结论

连续培养漆酶的酶活在前5 d的增速较快，到第5天就达到较高的酶活值。连续培养缩短了培养周期，可在相对较短时间得到大量高活漆酶。利用连续培养白腐菌得到的大量的粗漆酶来处理木粉，活化其木质素成分，增加了木粉中化学键的数量，使胶结点增多，可以替代一部分的脲醛树脂胶。以适当的比例m(脲醛树脂)∶m(木粉)=9∶1将二者混合后与漆酶活化后的木质纤维热压制成纤维板，力学性能都有所提高。

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收稿日期：2015年10月21日。

作者简介：第一郁昭轩，男，1994年3月生，东北林业大学林学院，本科生。E-mail：18745012652@qq.com。通信作者：陈广胜，生物质材料科学与技术教育部重点实验室(东北林业大学)，教授。E-mail：kjc_chen@163.com。

1)国家自然科学基金面上项目(31170515)、高等学校博士学科点专项科研基金(博导类)(20130062110012)、东北林业大学大学生创新训练计划项目(201410225157)。

责任编辑：戴芳天。