网线接头上脱落细胞采集方法对STR分型的影响

吴渊虬刘宗伟陶陆阳（苏州大学 江苏 苏州 5007；常熟市公安局 江苏 苏州 5500）

网线接头上脱落细胞采集方法对STR分型的影响

吴渊虬1刘宗伟2陶陆阳1
（1苏州大学 江苏 苏州 215007；2常熟市公安局 江苏 苏州 215500）

探究网线接头上的脱落细胞进行STR分型的可行性及脱落细胞不同的采集方法对STR分型结果的影响。通过比较发现剪取法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型37例中检出12个以上基因座达33例，显著高于擦拭法，得出剪取法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型效果更优的结论。

法医物证 网线接头 脱落细胞 STR分型

接触性DNA检材是法医学DNA检验的热点和难点问题之一，这类检材所含有的DNA样本属于低拷贝(Low Copy Number，LCN)模板，即DNA含量小于100pg的样本。接触性DNA检材不仅存在于犯罪现场，往往也会存在于犯罪嫌疑人或被害对象的用具、衣物等客体上。随着犯罪嫌疑人警惕性的不断提高，一些明显可见的生物物证（如血痕、毛发、精斑等）常被犯罪嫌疑人销毁破坏，但来自人体粘膜或皮肤表面的脱落细胞由于微小痕量却常被忽略，如遗留在口罩、饮料瓶、烟蒂上的口腔上皮细胞；遗留在刀柄、指纹、手套上的体表脱落细胞，对于这类生物物证，一旦能够成功检验分析出其中的DNA样本，就能为案件的侦破提供有效的科学证据[1]。本文以现场遗留的网线接头作为检材，通过擦拭法和切割法两种方法提取网线接头上的微量脱落上皮细胞并进行STR分型，探究网线接头提取DNA检材的可行性并筛选出高检出率的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

2012 年以来本实验室受理案件中的网线接头70份，其中33份由现场勘查人员采用擦拭法采集网线接头上的脱落细胞，标记为检材I；37份由本实验室人员采用剪取法采集网线接头上的脱落细胞，标记为检材II。

1.2 主要设备和试剂

GeneAmp PCR System 9700型定量PCR仪，ABI3500XL型荧光分析仪，GeneMapper ID-X分析软件，AmpFISTR Identifiler Plus（AB）试剂盒，D盾超敏DNA提取试剂盒。

1.3 实验方法和样品的准备

1.3.1 检材采集方法

（1）擦拭法：取一根干棉签吸取适量去离子水，在网线接头上的水晶头弹片表面来回擦拭一次，再取第二根干棉签擦拭水晶头弹片表面，将两根棉签置于D盾超敏DNA提取试剂盒1.5mL离心管的套管内；再以同样方法擦拭网线接头表面的其余部位，将棉签置于上述离心管套管内。

（2）剪取法：用剪刀将网线接头上的水晶头弹片剪下，置于D盾超敏DNA提取试剂盒1.5mL离心管底部，在离心管内加置离心套管；取一根干棉签吸取适量去离子水，在网线接头表面的其余部位往复擦拭一次，再取第二根干棉签擦拭网线接头表面的其余部位，将两根棉签置于上述离心管套管内。

1.3.2 改良硅珠法DNA提取和纯化步骤

（1）检材I的DNA提取和纯化：①在放有棉签的离心套管内加入180μL裂解液，99℃裂解5分钟；②8000g离心2分钟，弃套管，加入吸附液1000μL，硅珠16μL，蜗旋后静置15分钟；③8000g离心1分钟，弃上清，加入800μL漂洗液，充分混匀后8000g离心1分钟，弃上清；④置于56℃金属浴上烘干沉淀物，后加入20μL洗脱液，充分混匀后置于56℃金属浴上洗脱15分钟；⑤16000g离心2分钟，取上清液进行PCR。

（2）检材II的DNA提取和纯化：①在放有棉签的离心套管内加入180μL裂解液，99℃裂解5分钟；②8000g离心2分钟，弃套管，试管在99℃二次裂解5分钟；③8000g离心2分钟，转移上清液至另一试管内，加入吸附液1000μL，硅珠16μL，蜗旋后静置15分钟；④8000g离心1分钟，弃上清，加入800μL漂洗液，充分混匀后8000g离心1分钟，弃上清；⑤置于56℃金属浴上烘干沉淀物，后加入20μL洗脱液，充分混匀后置于56℃金属浴上洗脱15分钟；⑥16000g离心2分钟，取上清液进行PCR。

1.4 PCR扩增反应

反应体系为15μL，包括mix 6μL，prime set 3μL，模板DNA6μL。热循环条件为95℃11分钟、94℃20秒、59℃3分钟，共30个循环，最后60℃延伸10分钟。

1.5 PCR扩增产物分析

PCR扩增产物应用ABI3500XL型荧光分析仪进行毛细管电泳，用GeneMapper ID-X软件分析STR基因型。

2 结果

2012 年以来涉案电脑附件网线接头的检测结果统计如下表所示。表中结果显示，33例擦拭法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型检出12个以上基因座22例，其中单一个体12例，混合个体10例，检出12个以下基因座11例；37例剪取法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型检出12个以上基因座32例，其中单一个体21例，混合个体11例，检出12个以下基因座5例。通过对比实验结果，发现剪取法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型效果更优。

表 涉案检材相关统计数据

3 讨论

相关实验证明人体只需接触物体表面5秒钟就可能有上皮脱落细胞遗留在物体的表面[2,3]。手是犯罪嫌疑人在作案过程中接触现场物体最多的部位，在其接触过的物体表面很可能会遗留下手指上的脱落细胞。正常情况下，人体皮肤表面的脱落细胞多数为已经角质化的细胞，这是由于人体皮肤表面的细胞会随着新陈代谢不断更新，为了抵御外界的各种刺激逐渐移动、分化，并最终成为角质细胞，而角质细胞的细胞核已经解体，无法从中获得足够多的DNA样本进行STR分型，但在某些情况下，如与物体摩擦或皮肤出汗时，会留下较多的有核上皮细胞[4,5]。犯罪嫌疑人在盗窃电脑过程中将网线接头拔出时手指必定会按压网线接头上的水晶头弹片，手指必定会与网线接头发生一定摩擦，因此在网线接头上留下的上皮脱落细胞中有一部分是新生的有核细胞，从这些新生的有核细胞中就能够提取到未降解的细胞核DNA，再运用STR分型检测就能为案件的侦破提供关键线索。但如何把网线接头上的DNA尽可能地转移至离心管内是提高STR检出率的关键所在。

接触性DNA检材所含有的DNA样本属于低拷贝模板，需要获得足够多的DNA样本才能进行有效的STR分型[6]。因此，在提取和转移接触性DNA检材的过程中应尽量多采集载体表面的脱落细胞，以求获取到足够多的DNA样本进行STR分型检测。一般情况下，当DNA STR分型检出的位点大于或等于12个基因座时代表检测效果较好，可以进行个体识别。

横向分析上表中的结果显示，并不是所有的样本都能得到明确的STR分型。样本能否得到明确分型关键取决于以下两方面：一方面是犯罪嫌疑人在作案过程中是否戴手套；另一方面是犯罪嫌疑人接触网线接头时间的长短。同时，犯罪嫌疑人在盗窃过程中的主要接触部位水晶头弹片面积小，网线接头上留有的脱落上皮细胞含量非常低，属于极微量检材，并且不同的犯罪嫌疑人的生理特征及在作案过程中的行为习惯是不同的，这就导致他们遗留在网线接头上的脱落细胞在数量和成分上会有所不同，而同一犯罪嫌疑人在不同的生理状态和外部环境下，体表脱落细胞的构成也是不同的，这就导致了实验中有些样本不能得到明确的STR分型。

纵向分析上表中的结果显示，剪取法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型检出12个以上基因座例数高于擦拭法，其中单一个体例数前者也远远多于后者。这是由于网线接头的表面积较小，特别是水晶头弹片，限制了反复擦拭的幅度，并且擦拭载体转移也会损失部分脱落细胞，增加了上皮脱落细胞获取的难度，因此，利用擦拭法擦拭网线接头的表面不能有效地获取到足够多的上皮脱落细胞用于STR分型[7-9]，这样就降低了DNA STR检测的检出率。而通过观察网线接头的结构发现，犯罪嫌疑人在盗窃电脑过程中用手拔出网线接头时手指必定会按压到网线接头上的水晶头弹片，因而本实验室人员采用的剪取法是将网线接头上的水晶头弹片剪下放入试管底部用于二次裂解，这是区别于擦拭法的关键步骤，这一步骤能将水晶头弹片上的脱落细胞完全转移至离心管内，避免了擦拭法不能完全获取到水晶头弹片上脱落细胞的弊端，大大增加了可用于STR分型的脱落细胞数量，而之后再反复擦拭网线接头表面的其余部分，降低了上皮脱落细胞获取的难度，能从网线接头上获取到尽可能多的上皮脱落细胞，并且水晶头弹片大多为塑料材质，属于非渗透性检材，二次裂解的效果好，有效地提高了DNA STR检测的检出率。

总之，用针对性的方法获取网线接头上的脱落上皮细胞及在严格控制污染的条件下，网线接头上附着的脱落细胞可作为一种法医生物学检材，其DNA STR分型结果能为案件侦破提供指导作用，而采用剪取法采集网线接头上的脱落细胞进行STR分型效果更优。参考文献：

[1]张天祥,刘海东,邢立学,等.接触性DNA及其现场发现[J].法制与社会,2009(26):352.

[2]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京:中国人民公安大学出版社,2003:332-334.

[3]张晓红,吴微微.3种常见体表痕迹接触性DNA的检验[J].刑事技术,2012(6):52-54.

[4]袁丽,鲁涤,刘耀.低拷贝DNA模板检验方法探讨[J].中国法医学杂志,2009(6):383-385.

[5]Fregeau CJ,Germain O,Fourney RM.Fingerprint enhancementrevieitedandtheeffectsofbloodenhancement chemicals on subsequent Profiler Plus fluorescent short tandenm repeat DNA analysis of fresh and aged bloody fingerprints[J].JForensicSci,2000,45(2):345-380.

[6]Gill P.Application of law copy number DNA Profiling[J].Croatian MedicalJournal,2001,42(3):229-232.

[7]姚建,贾东涛,张玉红,等.检材量对硅珠法提取脱落细胞DNA的影响[J].中国法医学杂志,2009(5): 333-334.

[8]王林生,苏勇,顾林岗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学杂志,2000,15(1):36-37.

[9]杨帆,梅善宗,李永宏,等.签字笔上附着的脱落上皮细胞STR分型[J].法医学杂志,2008(1):34-37.

DF795.2

A

2095-7939(2016)01-0071-03

2014-11-25

吴渊虬（1988-），男，江苏常熟人，江苏省常熟市公安局刑警大队DNA实验室助理工程师，苏州大学硕士研究生，主要从事法医物证学研究。

孟凡骞）