X射线对BGC-803胃癌细胞凋亡及Survivin蛋白表达的影响

任振泰　王晓瑜

(郑州大学第五附属医院 放疗科　河南 郑州　450052)



X射线对BGC-803胃癌细胞凋亡及Survivin蛋白表达的影响

任振泰王晓瑜

(郑州大学第五附属医院 放疗科河南 郑州450052)

【摘要】目的分析X射线对BGC-803胃癌细胞凋亡及Survivin蛋白表达的影响。方法将BGC-803胃癌细胞分为对照组、实验组；实验组分别给予1、2、5 Gy X射线照射。流式细胞仪检测各组细胞凋亡及Survivin蛋白表达情况。结果随着X射线剂量增大，BGC-803细胞凋亡率增大；在2 Gy、5 Gy组，随X射线照射时间延长，细胞凋亡率增大，而1 Gy组无明显改变。大剂量(5 Gy)X射线引起BGC-803胃癌细胞Survivin蛋白表达增加，而小剂量X射线(1 Gy、2 Gy组)对BGC-803胃癌细胞Survivin蛋白表达无显著影响。结论X线辐射引起BGC-803胃癌细胞凋亡具有辐射剂量、时间依赖性；大剂量X射线照射使Survivin蛋白表达增加，可能与细胞周期、DNA同源重组修复有关。

【关键词】胃癌；X射线；Survivin蛋白

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国发病数及死亡数均位于第3位[1]。手术是胃癌的主要治疗手段。早诊断、早手术是有效提高患者预后的因素[2]，晚期胃癌的5年生存率很低[3]。局部复发和远处转移是胃癌术后失败的主要原因。为提高胃癌治疗疗效，围手术期综合治疗显得尤为重要，单纯或者辅助放射治疗越来越受到重视。Survivin基因作为凋亡抑制家族的一员，主要作用为抑制细胞凋亡、干扰细胞周期、促进细胞分裂和增殖、促进血管生成等[4-8]。Survivin蛋白特异性高表达与肿瘤的恶性程度、远处转移、预后不良呈正相关。有研究认为，其高表达与放射治疗敏感性也有关系[9]。本研究拟通过体外实验对BGC-803胃癌细胞X线外照射，观察细胞凋亡、Survivin 蛋白表达情况，并分析它们之间的关系，为动物实验或临床实验提供依据。

1材料与方法

1.1细胞株与试剂BGC-803胃癌细胞购于协和细胞室，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国GIBCO公司， 兔IgG多抗购自美国Santa Cruz公司，标记山羊抗兔IgG、山羊血清购自中国北京中杉公司，碘化丙啶购自美国Sigma公司。

1.2实验方法实验分为对照组和实验组(照射剂量1、2、5 Gy)，每组设4个复孔。将对数生长期的BGC-803胃癌细胞悬液接种到24孔板，细胞浓度为1×105个/孔，培养24 h，室温下进行X射线垂直照射，不同组照射剂量分别为1、2、5 Gy。放射线照射后分别于0、2、4、6 h终止培养。

1.2.1照射方法采用美国Varian Clinac 23EX直线加速器，6MV-X线照射，源皮距100 cm，剂量率3 Gy/min，1.5 cm组织补偿胶遮挡。

1.2.2细胞凋亡检测终止培养后去培养液，以0.25%的胰酶消化贴壁细胞，吹打混匀形成单细胞悬液。收集细胞，PBS洗涤两次(离心2 000 rpm，5 min)，后配置成浓度为5×105cell/ml的单细胞悬液，将悬液移液至离心管，1 000 rpm，4 ℃离心10 min，弃上清；加入500 μl的Binding Buffer，轻轻吹打混匀为混悬细胞液；加入5 μl Annexin V-FITC轻轻混匀；加入5 μl PI，混匀；室温下避光反应，在1 h内上机检测。独立重复3次。用Modfit软件分析细胞凋亡，结果以百分率表示。

1.2.3Survivin蛋白检测终止培养后去培养液，以0.25%的胰酶消化贴壁细胞，吹打混匀形成单细胞悬液。收集细胞，PBS洗涤两次(离心2 000 rpm，5 min)，后配置成浓度为5×105cell/ml的单细胞悬液。特异组加Survivin兔IgG多抗50 μl(非特异组加50 μl PBS)，4 ℃条件下作用45 min；加入封闭山羊血清50 μl，4 ℃反应30 min，PBS洗涤2次；加入FITC标记山羊抗兔IgG 50 μl，4 ℃反应45 min。PBS洗涤两次后上机检测，利用Cell Quest软件分析。Survivin蛋白表达=特异组阳性百分数-非特异组阳性百分数。独立重复3次。

1.3统计学方法采用SPSS 15.0数据分析软件包完成数据处理及统计分析，多组样本均数的比较使用One-Way ANOVA。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1X射线对BGC-803胃癌细胞凋亡的影响1 Gy照射组细胞凋亡差异无统计学意义(P>0.05)；4 h与6 h时间点随X射线剂量增大，BGC-803胃癌细胞凋亡率增大，差异有统计学意义(P<0.05)；随观察时间延长，2 Gy组及5 Gy组细胞凋亡率增大，差异有统计学意义(P<0.05)。X射线对BGC-803胃癌细胞凋亡率具有辐射剂量、时间依赖性。见表1。

表1　X射线对BGC-803胃癌细胞凋亡率的影响

注：与对照组比较，aP<0.01；与1 Gy组、2 Gy组同时间点比较，bP<0.01；组内与0 h及2 h时间点比较，cP<0.01。

2.2X射线对BGC-803胃癌细胞Survivin蛋白表达的影响小剂量(1、2 Gy)X射线对BGC-803胃癌细胞survivin蛋白表达无影响(P>0.05)；大剂量(5 Gy)X射线引起BGC-803胃癌细胞survivin蛋白表达增加(P<0.05)。见表2。

表2　 X射线对BGC-803胃癌细胞Survivin

注：与对照组、1 Gy组、2 Gy组比较，dP<0.01；组内与0 h时间点比较，eP<0.01。

3讨论

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发生是受多因素影响的复杂病理过程，主要表现为细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻。临床确诊时，大部分胃癌已经处于进展期。对于进展期或术后复发患者，没有特效治疗方案，预后较差。肿瘤细胞的过度增生、凋亡抑制在胃癌恶化进展过程中发挥着重要作用。如何控制胃癌恶化进展已经成为临床亟待解决的问题。Survivin基因在胃癌组织中高表达已得到证实，而正常胃黏膜组织无表达[10]。Survivin作为凋亡抑制因子，其高表达预示着癌症进展以及预后不良，影响了放射治疗的敏感性[11-12]。研究细胞Survivin蛋白表达与放射治疗以及细胞凋亡的关系，对于指导恶性肿瘤的治疗具有重要意义。

本研究中，不同剂量X射线照射BGC-803胃癌细胞后，细胞凋亡率具有剂量、时间依赖性，表现为随照射剂量增大、时间延长，细胞凋亡率增大。大剂量(5 Gy)X射线辐射BGC-803胃癌细胞引起Survivin蛋白表达增加。本实验表明，X线辐射导致BGC-803胃癌细胞高凋亡率的同时伴有Survivin蛋白高表达。考虑以下原因：放射生物学认为，有丝分裂期细胞或接近有丝分裂期，即G2/M期细胞是放射最敏感细胞，易引起辐射凋亡[13]；在整个细胞周期中Survivin蛋白高表达主要在G2期或者Survivin使细胞周期阻滞在G2/M期；Survivin蛋白高表达G2期BGC-803胃癌细胞，容易引起辐射诱导的凋亡。染色体DNA是X射线辐射引起细胞凋亡的靶位；DNA受到辐射损伤，特别是亚致死性损伤后，具有自我损伤修复能力；高表达的Survivin蛋白抑制细胞凋亡。本实验中凋亡率与Survivin蛋白表达呈正相关，考虑Survivin基因与DNA损伤后的同源重组修复有关[14]。

放射生物学认为，放射敏感肿瘤常常是低分化、高恶性肿瘤，受到辐射后易引起辐射凋亡[13]。体外细胞实验结果提示，Survivin蛋白高表达容易辐射凋亡。但是艾秀清等[12]通过临床实验提示，Survivin蛋白低表达增加了放射治疗的敏感性，Survivin蛋白高表达组细胞凋亡指数低。这与本研究以及经典的放射生物学理论不同。这种差异考虑以下原因：体内、体外实验标本差异；放射治疗前的化疗对Survivin蛋白表达有影响；本研究观察终止时间为X线辐射后6 h；细胞受到辐射后丧失克隆能力，进行有限的几次有丝分裂，高表达Survivin蛋白参与了损伤修复、抑制凋亡。具体原因需要实验进一步验证。

总之，X线辐射引起BGC-803胃癌细胞凋亡具有辐射剂量、时间依赖性，伴有Survivin蛋白高表达，可能与细胞周期、同源重组修复有关，为下一步实验或者探讨二者机制提供了方向。

参考文献

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Effects of X-ray on apoptosis of BGC-803 gastric cancer cell and expression of Survivin protein

Ren Zhentai, Wang Xiaoyu

(DepartmentofRadiotherapy,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of X-ray on apoptosis of BGC-803 gastric cancer cells and expression of Survivin protein. MethodsThe BGC-803 gastric cancer cells were divided into control group and experimental groups(radiation doses were 1、2、5 Gy, respectively). Apoptosis of BGC-803 gastric cancer cells and expression of Survivin protein were detected by flow cytometry. ResultsThe apoptosis rate of BGC-803 cancer cells was increased accompanied by the increase of X-ray dose. The apoptosis rate of BGC-803 cancer cells in 2、5 Gy groups was increased with the passage of time, but there was no chage in 1 Gy group. Low dose(1、2 Gy) of X-ray had no effect on the expression of Survivin protein, but 5 Gy group had increased the expression. ConclusionThe apoptosis of BGC-803 cancer cells was induced by X-ray in a dose- and time-dependent manner. High dose X-ray increased the expressiong of Survivin protein. It may be associated with DNA repair by homologous recombination or cell cycle.

【Key words】gastric cancer; X-ray; survivin proteitn

(收稿日期：2015-12-28)

【中图分类号】R 735.2

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.004

通讯作者：任振泰，E-mail：rdf_zzu@126.com。