当归饮子对银屑病模型豚鼠皮肤Filaggrin和Caspase-14基因及蛋白表达的影响

文　谦， 黄　刚， 李芳梅， 杨志波

(1新疆医科大学附属中医医院皮肤科， 乌鲁木齐　830000； 2新疆医科大学中医学院中医系， 乌鲁木齐　830011；

3湖南中医药大学研究生院， 长沙　410208； 4湖南中医药大学第二附属医院皮肤科, 长沙　410005)



当归饮子对银屑病模型豚鼠皮肤Filaggrin和Caspase-14基因及蛋白表达的影响

文谦1， 黄刚2， 李芳梅3， 杨志波4

(1新疆医科大学附属中医医院皮肤科， 乌鲁木齐830000；2新疆医科大学中医学院中医系， 乌鲁木齐830011；

3湖南中医药大学研究生院， 长沙410208；4湖南中医药大学第二附属医院皮肤科, 长沙410005)

摘要：目的探讨当归饮子对寻常型银屑病模型豚鼠皮肤丝聚蛋白(Filaggrin)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14(Caspase-14)基因及蛋白表达的干预变化。方法建立寻常型银屑病动物模型，分为当归饮子组、甲氨蝶呤组，生理盐水组、模型对照组、空白对照组做对照，用逆转录PCR(RT-PCR)和免疫印迹试验(Western Blot)法检测造模皮损部位Filaggrin、Caspase-14基因及蛋白表达，分析寻常型银屑病动物模型皮损与皮肤屏障功能密切相关的基因及蛋白表达的变化。结果豚鼠耳部皮肤银屑病模型造模成功。模型对照组皮损中Filaggrin(0.178±0.009)、Caspase-14(0.153±0.008)基因蛋白表达较低，药物组干预后，当归饮子组与甲氨蝶呤组皮肤Filaggrin、Caspase-14基因蛋白表达增强(P<0.01)，且当归饮子组较甲氨蝶呤组增强明显(P<0.01)。结论当归饮子能增强银屑病模型豚鼠皮肤Filaggrin和Caspase-14基因及蛋白的表达，对改善银屑病动物模型的皮肤屏障功能作用肯定，效果优于甲氨蝶呤组。

关键词：当归饮子； 寻常型银屑病； 动物模型； 皮肤屏障功能

寻常型银屑病的发病机制尚不完全清楚。近年研究表明皮肤的屏障功能异常与银屑病有密切关系，恢复皮肤的屏障功能在寻常型银屑病的治疗和预防复发中的作用受到关注。功能正常的皮肤表面有一层保护膜，由汗腺、角质层蒸发的水分和各种天然保湿因子组成，形成基本的防线。环境或疾病的原因可导致这种保护膜破坏，容易受到病源的入侵，主要表现为表皮细胞间基质合成障碍，经表皮水分丢失增加，皮肤干燥脱屑，并继发或加重表皮细胞的增殖及角化异常[1]。如果角蛋白、角质包膜蛋白先天基因缺陷或脂质合成异常，会发生一些皮肤病[2]。在皮肤角质层中，丝聚蛋白(Filaggrin)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14(Caspase-14)是参与皮肤屏障的重要因子，主要功能是参与表皮细胞的分化及皮肤屏障的形成。Filaggrin和Caspase-14可以作为评价皮肤屏障功能的重要指标[3]。

本研究致力于皮肤屏障功能与银屑病关系的研究，通过观察当归饮子(选自《重订严氏济生方》)对寻常型银屑病动物模型的干预，用逆转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)和免疫印迹试验(Western Blot)法检测造模皮损部位Filaggrin和Caspase-14基因及蛋白表达，分析寻常型银屑病动物模型皮损与皮肤屏障功能密切相关蛋白及基因表达的变化，阐述当归饮子对银屑病模型豚鼠皮肤Filaggrin和Caspase-14基因及蛋白表达的影响。

1材料和方法

1.1材料中药制剂：当归20 g，白芍20 g，生地20 g，川芎15 g，防风20 g，荆芥20 g，何首乌20 g，白蒺藜20 g，黄芪25 g，甘草10 g，每剂药第1次加水1 500 mL，水开后煎煮30 min，倒出，然后再加水1 200 mL，水开后煎煮30 min，倒出，再加水800 mL，水开后煎煮25 min，混合3次药液，每剂药浓缩至300 mL。豚鼠40只，其中雄性20只，雌性20只，体质量210～250 g，由中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供。实验动物质量合格证：SCXK(军)2012-0006，合格证编号：0022614，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2012-0047。

1.2建模与药物处理以5%心得安乳剂均匀涂于豚鼠耳背皮肤，厚度1.0 mm，每日3次，连续2 w，使其符合银屑病样病理改变[4]。40只豚鼠，空白对照组8只，余下32只造模后随机分为模型对照组、生理盐水组、当归饮子组和甲氨蝶呤组4组，每组8只。空白对照组实验期间正常饲养。生理盐水组用生理盐水灌胃，3次/d，每次每只0.01 mL/g体质量，连续2 w。当归饮子组用稀释的中药灌胃，每次每只0.01 mL/g体质量，3次/d，连续2 w。甲氨蝶呤组：按成人常规用量的5倍口服给药，给药剂量为0.5 mg/kg体质量，每日1次，连续2 w。

1.3标本取材及病理切片2 w后，模型对照组4只豚鼠处理耳部皮肤用10%福尔马林固定，常规标本脱水，透明，石蜡包埋，行连续性切片，厚约4 μm，HE染色。由病理专业人员在光学显微镜下观察皮肤有无变性坏死、溃疡、痂皮形成，上皮层次有无增厚，表面角化不全，真皮或皮下组织内有无充血、水肿、炎细胞浸润等病变。处死模型对照组另外4只与其余组豚鼠，分离耳部皮肤，绞碎组织，-80℃液氮冻存。

1.4Western Blot法检测Filaggrin、Caspase-14蛋白表达手动匀浆组织，加入蛋白裂解液，离心，获得全蛋白提取物，进行蛋白定量测定，取适量(50 μg)蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转至硝酸纤维膜上，加入一抗(用一抗稀释液稀释)，4℃冰箱过夜孵育后洗涤加入二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤缓冲液洗涤后，增强化学发光法(ECL)显色，使用G:BOX chemiXR5成像。

1.5RT-PCR法检测Filaggrin、Caspase-14基因表达按RT-PCR反转录试剂盒说明书操作。采用软件Primer5设计引物(由南京金斯瑞科技有限公司合成)，引物序列见表1，所有基因PCR反应条件为：95℃5 min，变性95℃30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，32个循环，终末延伸72℃ 10 min。

1.6PCR产物鉴定PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上成电泳、免疫印迹，增强化学发光法(ECL)显色，并使用G:BOX chemiXR5成像，所有扩增产物的光密度峰值均以GAPDH为基准校正。使用Gel-Pro32软件对结果进行灰度分析。

表1　各引物序列号及产物大小

2结果

2.1造模结果豚鼠一般情况良好，没有死亡。4块豚鼠耳皮肤组织双面被覆复层鳞状上皮，上皮下可见真皮和皮肤附件，中间为软骨，4块组织病变相似。光学显微镜下示：表面角化过度，上皮外局部区域可见由炎细胞和厚度片块状角化无组成的痂皮。鳞状上皮增生，层次厚，厚薄不一，真皮可见毛囊、皮脂腺。上皮基底层细胞增生，向真皮延伸。真皮有轻度或中度充血及轻度或中度炎细胞浸润，炎细胞为单核巨噬细胞和嗜酸性粒细胞。豚鼠耳部皮肤银屑病模型造模成功(图1、2)。

2.2Western Blot检测Filaggrin、Caspase-14蛋白电泳结果模型对照组和生理盐水组Filaggrin、Caspase-14蛋白少量表达，当归饮子组和甲氨蝶呤组表达明显增加，见图3。

注：1:空白对照组；2:模型对照组；3:生理盐水组；4:当归饮子组；5:甲氨蝶呤组

图3Filaggrin、Caspase-14蛋白电泳图

2.3各组豚鼠皮肤组织细胞中Filaggrin、Caspase-14蛋白表达模型对照组与生理盐水组Filaggrin、Caspase-14蛋白表达较空白对照组明显下降(P<0.01)，当归饮子组和甲氨蝶呤组Filaggrin、Caspase-14蛋白表达较模型对照组明显上升(P<0.01)，且当归饮子组较甲氨蝶呤组上升明显(P<0.01)，与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且当归饮子组优于甲氨蝶呤组；生理盐水组与模型对照组造模组Filaggrin、Caspase-14蛋白表达水平，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2各组模型豚鼠皮肤组织细胞中Filaggrin、

组别只数FilaggrinCaspase-14空白对照组80.740±0.0440.690±0.036模型对照组40.178±0.009*0.153±0.008*生理盐水组80.233±0.014*0.261±0.015*当归饮子组80.650±0.032△0.595±0.033△甲氨蝶呤组80.495±0.028△▲0.493±0.027△▲

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型对照组比较；△P<0.01；与当归饮子组比较，▲P<0.01。

2.4RT-PCR检测Filaggrin、Caspase-14电泳结果PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳后，在352、417、262 bp处分别见GAPDH内参、Filaggrin mRNA和Caspase-14 mRNA的表达(图4)。Filaggrin mRNA和Caspase-14 mRNA在不同模型组表达不一，模型对照组和生理盐水组表达最弱，而药物(当归饮子、甲氨蝶呤)组较前者表达明显增加，空白对照组表达最强。

2.5 RT-PCR检测Filaggrin、Caspase-14基因表达模型对照组与生理盐水组Filaggrin、Caspase-14基因表达较空白对照组明显下降(P<0.01)，当归饮子组和甲氨蝶呤组Filaggrin、Caspase-14基因表达较模型对照组明显上升(P<0.01)，且当归饮子组较甲氨蝶呤组上升明显(P<0.01)，与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且当归饮子组优于甲氨蝶呤组；生理盐水组与模型对照组造模组Filaggrin、Caspase-14基因表达水平，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

注：1:空白对照组；2:模型对照组；3:生理盐水组；4:当归饮子组；5:甲氨蝶呤组

图4各组Filaggrin mRNA和Caspase-14 mRNA PCR电泳图

表3各组模型豚鼠皮肤组织细胞中Filaggrin、

组别只数FilaggrinCaspase-14空白对照组80.735±0.0380.743±0.046模型对照组40.173±0.009*0.163±0.009*生理盐水组80.186±0.010*0.171±0.012*当归饮子组80.576±0.027△0.594±0.035△甲氨蝶呤组80.479±0.022▲0.455±0.025▲

注：与空白对照组比较，*P<0.01； 与模型对照组比较；△P<0.05；与当归饮子组比较，▲P<0.01。

3讨论

银屑病的病因和病机复杂，包括遗传因素、基因突变、精神、环境、饮食、药物、病源微生物等多种因素，从病因看银屑病发病是一个复杂的过程。现代研究认为，皮肤角质层角化过度增殖、炎症细胞因子刺激、皮肤免疫功能异常、皮肤屏障功能受损都是银屑病发病过程中的机制。Filaggrin与Caspase-14之间存在着紧密的联系。皮肤受到不良因素刺激后，细胞受损，皮肤屏障受到影响，丝聚蛋白原(Pro-filaggrin)被Caspase-14迅速去磷酸化成为Filaggrin，进而水解成各种天然保湿因子，保持角质层含水量，参与皮肤水合作用，维护皮肤屏障[5-6]。本研究试图从皮肤的物理屏障功能的角度，研究药物干预后的变化。

本研究通过银屑病动物造模，观察到造模皮损和银屑病的皮损相似，表现为角化、红斑、鳞屑、血管扩张等，病理检测结果示造模皮损和银屑病病理表现相似。从临床表现和病理切片分析，此为中医血热夹虚、本虚标实之证。予以当归饮子清热祛风止痒，兼养血润燥。本研究模型豚鼠皮肤组织细胞中Filaggrin、Caspase-14基因及蛋白表达降低(P<0.01)，表明这2种蛋白参与了银屑病的病理演变，直接或间接影响了皮肤的屏障功能；药物干预后，当归饮子组和甲氨蝶呤组Filaggrin、Caspase-14基因及蛋白表达都增强，表明药物干预对银屑病模型病理变化有改善作用，且当归饮子组优于甲氨蝶呤组(P<0.01)。生理盐水组与模型对照组造模组Filaggrin、Caspase-14蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示生理盐水组对模型病理变化没有影响。

Caspase-14是调节Profilaggrin去磷酸化成为Filaggrin的关键酶[7]。Caspase-14的表达调节大多是通过Profilaggrin被Caspase-14迅速去磷酸化成为Filaggrin这一途径完成[8]。本实验中，当归饮子干预可使Filaggrin 、Caspase-14基因及蛋白表达增强，说明当归饮子改善银屑病动物模型的皮肤屏障功能作用肯定。由于银屑病的发病机制不明，有复杂的生物学效应参与银屑病发病过程[9-10]，而且从单一的信号通路和某些物质的变化机制研究不能说明中药复方的作用机制，所以，当归饮子修复皮肤屏障功能的机制可能是通过多靶点、多途径、多层次而起作用，以后的研究方向可以结合蛋白组学进行研究。

参考文献:

[1]Roberson ED,Bowcock AM. Psoriasis genetics:breaking the barrier[J]. Trends Genet,2010,26(9):415-423.

[2]Hesse M, Zimek A, Weber K, et al. Comprehensive analysis ofkeratin gene clusters in humans and rodents [J]. Eur J Cell Biol,2004,83(1):19-26.

[3]张芳芳, 车雅敏, 傅志宜, 等. Filaggrin和Caspase-14在皮肤屏障中的作用[J].皮肤性病诊疗学杂志, 2012, 19(2): 114-117.

[4]孙建方，高天文.皮肤组织病理学[M].北京：人民卫生出版社，2013：20-35.

[5]Yoneda K, Demitsu T, Manabe M, et al. Expression of wild-type, but not mutant, loricrin causes programmed cell death in HaCaT keratinoeytes[J]. Dermatology,2010, 37(11):956-964.

[6]Kim JH, Choi DK, Lee SS, et al. Enhancement of keratinocyte differentiation by rose absolute oil[J] Ann Dermatol,2010, 22(3):255-261.

[7]胡一梅, 艾儒棣, 钟振东, 等. 马齿苋提取物对接触性皮炎大鼠皮肤丝聚蛋白和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-14蛋白表达的影响[J].临床皮肤科杂志,2014, 43(2):80-82.

[8]Jiang YJ, Kim P, Uchida Y, et al. Ceramides stimulate caspase-14 expression in human keratinocytes[J]. Exp Dermatol, 2013, 22(2):113-118.

[9]Divekar AA, Dubey S, Gangalum PR, et al. Dicer insufficiency and microRNA-155 overexpression in lupus regulatory T cells:an apparent paradox in the setting of an inflammatory milieu[J]. J Immunol,2011,186(2):924-930.

[10]Sand M, Gambichler T, Sand D, et al. MicroRNAs and the skin:Tiny players in the body’s largest organ[J].J Dermatol Sci,2009,53(9):169-175.

(本文编辑杨晨晨)

The effect of Dangguiyinzi on the expression of Filaggrin and Caspase-14 gene and the proteins in psoriasis vulgaris model of guinea pig skin

WEN Qian1， HUANG Gang2， LI Fangmei3， YANG Zhibo4

(1DepartmentofDermatological,AffiliatedHospitalofChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China；2TraditionalChineseMedicineDepartment,TraditionalChineseMedicineCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；3GraduateSchool,HunanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changsha410208,China；4DepartmentofDermatological,SecondAffiliatedHospital,HunanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Changsha410005,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Dangguiyinzi on the expression of Filaggrin and Caspase-14 gene and the proteins in psoriasis vulgaris model of guinea pig skin. MethodsAnimal model of psoriasis vulgaris was established. Two model groups were intervened by Dangguiyinzi and methotrexate respectively, which were as therapy groups, while the other model animals were divided into physiological saline group, model group, and the other blank group were set as control. The gene and protein expression of filaggrin, cysteine aspartic acid protease 14 (Caspase-14) were measured by RT-PCR and Western blot assay. The expression of the genes and proteins which were closely related to skin lesions and skin barrier function in vulgaris psoriasis animal model were compared and analyzed. ResultsAnimal′s models of psoriasis vulgaris was made successfully. The proteins expression of Filaggrin(0.178±0.009) and Caspase-14(0.153±0.008)in psoriasis vulgaris model decreased significantly (P<0.01). After drug intervention，the expression index of Filaggrin and Caspase-14 increased in dangguiyinzi group (0.650±0.032，0.595±0.033) and methotrexate group (0.495±0.028，0.493±0.027)， and Chinese Angelica Decoction group increased obviously (P<0.01). ConclusionDangguiyinzi could enhance the expression of Filaggrin and Caspase-14 gene and protein of skin lesions in psoriasis vulgaris animal model . It had a definite effect for skin barrier function of psoriasis vulgaris animal model. The results indicated that the therapeutic effect was more effective than the methotrexate.

Keywords：Dangguiyinzi; Posriasis vulgaris; Animal model; Skin barrier function

[收稿日期：2015-11-12]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.04.008

中图分类号：R758.63

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)04-0418-04

作者简介：文谦(1968-)，男，硕士，主治医师，研究方向：中医药防治皮肤病的基础与临床研究。通信作者：杨志波，男，硕士,主任医师,教授,博士生导师，研究方向：皮肤病的临床与实验研究，E-mail：dr.yang888@126.com。

基金项目：国家自然科学基金课题(81273769); 湖南省科技计划项目(2011FJ3026)

·基础医学研究·