水貂源乳杆菌及双歧杆菌的分离鉴定

张璐++郭荣++刘慧++王志强++韩先杰++温建新

摘 要：取健康水貂粪便样经过处理后用MRS、TPY选择培养基进行筛选，筛选出主要优势菌为乳杆菌和双歧杆菌。对所筛选出的乳杆菌和双歧杆菌进行分离培养、生化试验鉴定和PCR鉴定。结果表明，乳杆菌和双歧杆菌为革兰氏阳性菌，糖醇发酵试验为阳性，并能抑制大肠杆菌生长，但对沙门氏菌无抑制作用。乳杆菌PCR鉴定中，在230 bp处有特异性条带，双歧杆菌在260 bp处有特异性条带。此试验为水貂专用微生态制剂的研制奠定了基础。

关键词：水貂；乳杆菌；双歧杆菌；分离；鉴定

中图分类号：S85 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.05.009

Isolation and Identification of the Lactobacillaceae and Bifidobacterium from Mink

ZHANG Lu， GUO Rong， LIU Hui， WANG Zhiqiang， HAN Xianjie， WEN Jianxin

（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University ， Qingdao，Shandong 266109，China）

Abstract：In this experiment dominant bacteria Lactobacillus and Bifidobacterium were screened in stool samples from healthy mink treated with MRS， TPY selective medium. The screening of Lactobacillus and Bifidobacterium were identified through isolation and culture， biochemical tests and PCR methods.The results showed that Lactobacillus and Bifidobacterium are gram-positive bacteria， the result of sugar alcohol fermentation test is positive， and they could inhibit the growth of E. coli， but had no effect on Salmonella. During PCR identification Lactobacillus has specific bands in 230 bp， Bifidobacterium has specific bands in 260 bp. This experiment laid a solid foundation for mink dedicated probiotics development.

Key words：mink； Lactobacillaceae； Bifidobacterium； separation； identification

目前，国内外关于水貂养殖用微生态制剂的研究较少，且大多局限于应用效果方面，而且缺少毛皮动物专用的微生态制剂。为改善和提高毛皮动物的抗病能力，提高繁殖性能和生产性能，最大程度地提高经济效益，本试验对从健康水貂粪便中分离的乳杆菌和双歧杆菌等菌种进行鉴定，以期为毛皮动物微生态制剂的研制开发奠定基础[1]。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 样品来源 健康水貂的粪便。

1.1.2 培养基 普通培养基（北京陆桥技术有限责任公司）、营养肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司）、改良MC培养基（北京陆桥技术有限责任公司）、TPY琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）、MRS培养基（北京陆桥技术有限责任公司）。

1.1.3 主要试剂 革兰氏染色液试剂盒（北京陆桥技术有限责任公司）、三糖铁琼脂、糖或醇发酵管（蜜二糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、木糖、山梨醇）、MR试剂、VP试剂、淀粉水解试验培养基、吲哚培养基、明胶液化试验培养基、硫化氢、尿素酶。

1.2 分离纯培养

称取新鲜水貂粪便样10 g，放入盛90 mL灭菌生理盐水的锥形瓶中，振摇约10 min，使之充分散开。静置后取5 mL上清液移于10 mL离心管中，此为10-1稀释液。用移液枪吸取10-1稀释菌悬液200 μL，滴于培养基平板上，用涂布棒涂布均匀，室温下静置5 min，将平板倒置于37 ℃恒温箱中培养18 h。

长出菌落后，挑取疑似单菌落，依次接种于改良MC培养基、TPY琼脂培养基、含碳酸钙的MRS培养基各3个，TPY琼脂培养基置于厌氧培养罐中，将所有平板于37 ℃恒温箱中进行纯培养，培养18 h，观察结果[2]。

1.3 革兰氏染色

对菌株分别进行革兰氏染色，在显微镜下观察细胞形态，记录结果。

1.4 生化鉴定

1.4.1 常规生化试验 分别挑取乳杆菌和双歧杆菌菌落，对菌落进行糖或醇的发酵试验（蜜二糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、木糖、山梨醇）、MR试验、VP试验、吲哚试验、硫化氢试验、淀粉水解试验、脲酶试验、枸橼酸盐试验、触酶试验、明胶液化试验、KOH试验[3]。

1.4.2 耐酸性试验 配制营养肉汤，用注射器吸取5 mL营养肉汤注入试管中，用HCl和NaOH调节pH值分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0（对照），并做好标记。 将各pH值培养基经121 ℃灭菌20 min后备用。