刘珊娜,范志华,孙溪,付荣霞,吴海清
(天津农学院 食品科学与生物工程学院,天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384)
李斯特菌噬菌体裂解酶的研究进展
刘珊娜,范志华,孙溪,付荣霞,吴海清
(天津农学院 食品科学与生物工程学院,天津市农副产品深加工技术工程中心,天津 300384)
摘 要:单核细胞增生李斯特菌是重要的食源性致病菌,可通过污染的食品进入人体,引发食品安全事件。噬菌体作为李斯特菌生物防治的有效手段,能够特异性识别菌体细胞,造成细菌裂解死亡。噬菌体发挥抑菌活性的关键在于其双链DNA所编码的裂解酶(肽聚糖水解酶类)能够在增殖过程的后期有效裂解宿主菌的细胞壁,将子代噬菌体释放到胞外环境中。本文综述了李斯特菌噬菌体裂解酶的种类、作用原理和结构特征,并探讨了裂解酶的应用领域和未来发展方向。
关键词:李斯特菌;噬菌体;裂解酶;研究进展
李斯特菌(Listeria)是一种兼性厌氧的革兰氏染色阳性短杆菌,存在于土壤、污水、饲料、动物和污染的食品中。在目前已确定的李斯特菌8个种属中,单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是致病力最强的细菌,也是迄今发现的唯一对人致病的菌种,其主要针对孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下的人群[1-2],致死率高达25%~30%。目前已知至少有13种血清型,引起食物中毒的血清型多为1/2和4b[3]。多种食品包括鱼和海产品、生香肠、奶酪、加工的肉制品等易受到LM的污染[4],由于该菌对各种应激(低温、低pH、高盐、低水分活度、氧化应激等)有一定程度的耐受性,因而进一步增加了对人类健康的危害性。
噬菌体能够特异性地识别菌体细胞,侵入宿主体内,完成增殖过程后裂解宿主细胞,释放子代噬菌体。噬菌体具有只针对活体细胞进行侵染的特点,因此在病原菌的检测和食品安全的生物控制方面起着越来越积极的作用[5-6]。国外对于噬菌体的开发研究逐渐成为热点,已有包括美国Omnilytics和EBI等公司相关研究产品的报道[7]。我国的研究起步较晚,仍处于实验室阶段。噬菌体发挥抑菌活性的关键在于其双链DNA所编码的裂解酶(肽聚糖水解酶类)能够在噬菌体增殖过程的后期有效裂解宿主菌的细胞壁,将子代噬菌体释放到胞外环境中[8-9]。对于噬菌体裂解酶的认识,将更有利于揭示噬菌体特异性的来源和进化规律,以及其与宿主菌的作用方式,为食源性LM的检测和感染的治疗提供新的途径和策略。
噬菌体是环境中大量存在的自我复制单元,可作用于特定的宿主细胞,其增殖过程可分为裂解途径和溶原途径。裂解途径中,噬菌体通过裂解细胞释放子代噬菌体;而在溶原途径中,噬菌体的DNA与宿主染色体整合,感染菌体后,不造成细胞死亡。噬菌体被认为是可生物降解的食品级无毒杀菌物质,开发的相关产品也被美国FDA 和EPA认可为GRAS级[10]。与抗生素相比,噬菌体来源广泛,增殖速度快,特异性好,不影响肠道正常菌群,安全性较高,使用成本较低[11]。1945年,Schultz[12]首次报道了噬菌体可以侵染李斯特菌属细菌。直至今日,超过400多种李斯特菌噬菌体从500多种环境来源中获得,基本属于长尾噬菌体家族(Siphoviridae)或肌尾噬菌体家族(Myoviridae)。大部分李斯特菌噬菌体表现出圆形排列的基因组结构,大小在30~65 kb之间,含有双链DNA负责编码结构基因,以及重组、复制、修复等功能基因,裂解基因和溶原控制基因(针对温和噬菌体)[13]等。李斯特菌噬菌体可应用于LM污染的控制,清除环境中的LM,如美国FDA批准的ListShieldTM、LMP-102和ListexTMP100等噬菌体试剂用于即食食品中LM的控制[14-15]。
噬菌体双链DNA编码的裂解酶基因在噬菌体增殖过程中表达,可以降解细菌细胞壁的肽聚糖层,在细胞壁上形成孔洞,最终使细胞裂解而释放子代噬菌体。不同噬菌体的裂解酶在蛋白结构和酶活性上存在较大差异,通常一种裂解酶只表现出一种水解活性。根据酶在细胞壁上的作用方式可分为5大类:(1)N-乙酰胞壁酸酶(N-acetylmuramidases),与溶菌酶类的机理相同;(2)N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidases),可以在多糖链中切断两个β-1,4糖苷键中的一个;(3)转糖基酶(lytic transglycosylases),切断肽聚糖中的多糖部分;(4)肽链内切酶(endopeptidases),切断多肽之间的连接;(5)N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidases),切断糖苷和多肽之间的化学键[8,16]。裂解酶不含有分泌信号肽,依靠疏水性跨膜蛋白holin的作用通过细胞内膜到达肽聚糖层。虽然holin的作用机理还未完全得到验证,但已证实裂解酶和holin分子都是裂解菌体、释放子代噬菌体所必需的,它们的编码基因位置相邻组成了裂解基因簇[17]。在噬菌体增殖的后期,holin分子和裂解酶同时表达。裂解酶不断在胞内积累,通过holin分子在内膜形成的孔道,到达肽聚糖层并迅速裂解细胞壁。但也有报道LM的A511噬菌体裂解酶基因上游并无编码holin的基因,有可能存在其他的胞内转运机理[18]。与裂解酶活性研究进展相比,有关裂解酶在细胞壁上受体的研究较少。已有研究结果表明,LM噬菌体裂解酶PlyP35能够识别LM细胞壁磷壁酸上的N-乙酰氨基葡萄糖(GLCNAC)残基[19]。而对于LM噬菌体裂解酶Ply118、Ply511和PlyP40,其直接作为结合配体的则是肽聚糖自身结构而非细胞壁磷壁酸[20]。
2002年,瑞士苏黎世联邦理工学院的Loessner课题组首次发表了LM噬菌体裂解酶的蛋白结构域,提出裂解酶由N端的酶活性域(EAD)和C端的细胞表面结合域(CBD)组成[21]。EAD决定酶的作用方式,CBD作为一个模式结构识别李斯特菌细胞表面的配体分子。不同LM噬菌体裂解酶的水解位点具有多样性,是由N端的EAD蛋白决定的。裂解酶的作用范围通常反映出菌株血清型的差异,这种差异性体现了CBD蛋白特异性识别宿主细胞配体的特点。对李斯特菌12种裂解酶基因序列比较研究表明,其在结合特异性、结合配体数量和亲和力上存在高度多样性[19]。如裂解酶Ply118仅对血清型为1/2的受试菌株表现出明显的结合作用,而裂解酶Ply500则只针对血清型为4、5和6的受试菌株。CBD是裂解酶与李斯特菌细胞壁结合所必须的,能够保证细胞裂解时裂解酶与底物的结合,避免裂解新的宿主细胞。CBD与李斯特菌的结合是一种非共价的快速结合,亲和力甚至可以与成熟抗体的结合力相比。当环境中存在CBD特异性抗体IgG时,CBD仍能和目标菌株细胞壁上的配体分子结合。由于酶的活性与结合蛋白的特异性可以独立存在而互不影响,因此通过基因工程手段替换任一结构域,可改变结合特性或酶活性。现已证实,重组表达的裂解酶蛋白可以快速裂解并杀灭环境中的LM,同时表现出高度的热稳定性[22]。与绿色荧光蛋白融合表达的CBD具有结合LM的特性,可作为指示分子在荧光显微镜下检测牛奶和奶酪样品中人为污染的LM,起到快速、准确的靶向作用[23]。
图1 噬菌体裂解酶作用方式
图2 李斯特菌噬菌体裂解酶结构域和氨基酸序列相关性[23]
在国外,LM噬菌体已用于食品污染的控制、防腐保鲜、微生物检测和感染的治疗等方面,我国关于LM噬菌体方面的研究报道较少。与使用噬菌体相比,使用裂解酶对宿主菌作用更迅速,裂解谱更广,可通过基因工程技术提高其产量。此外裂解酶的本质是蛋白质,作为食品添加剂的使用更容易获得法规许可。因此LM噬菌体裂解酶在食品和医疗等方面的探索研究也逐渐展开。如Gaeng等[24]将LM噬菌体裂解酶Ply118和Ply511在乳酸乳球菌中表达,获得了高活性的裂解酶,有效抑制了LM的生长。Schmelcher等人[23]将彩色荧光蛋白与LM噬菌体裂解酶CBD基因融合表达,将这种荧光标记的CBD蛋白加入到混合血清型的LM菌液中,可以通过多路成像技术分辨不同血清型的菌株。Kretzer等人[25]将荧光标记技术与CBD-磁珠分离技术结合,检测食品样品(牛奶、奶酪)中人为污染的LM。在增菌培养6 h后,检出下限在1~100 CFU/g。Walcher等[26]将CBD-磁珠与其他定量检测方法共用,可以使检测下限达到1 000 CFU/mL以下。目前,LM噬菌体裂解酶的应用仍是研究的前沿领域,未来的研究有望为降低病原菌感染和食品安全风险提供更多的途径。
LM是重要的食源性致病菌,威胁人体健康并造成了严重经济损失。LM噬菌体裂解酶能够从细胞内水解LM菌体细胞壁,使菌体裂解。从人们开始对LM噬菌体裂解酶的研究以来,其晶体结构、分子机制和作用特点不断得到认识。随着对病原菌快速检测技术和抗生素替代疗法的需求不断增加,基于噬菌体裂解酶的检测和诊断系统必将得到更多关注。噬菌体基因组分析的开展,也将更有利于裂解酶安全性和作用效果的评价。未来将利用分子生物学手段进行基因改造,阐明噬菌体裂解酶与宿主之间的相互作用,在实验室研究的基础上进一步评价噬菌体裂解酶在实际生产条件下的使用效果,拓宽对裂解酶生物学意义的认识,使噬菌体裂解酶的应用技术得到完善和发展。
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Research Progress in Listeria Phage Endolysins
LIU Shan-na,FAN Zhi-hua,SUN Xi,FU Rong-xia,WU Hai-qing
(Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing,College of Food Science and Bioengineering,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)
Abstract:Listeria monocytogenes is an important genus of food-borne pathogens.It may transmit into human body through contaminated food and cause food safety issue.Bacteriophages are effective means for Listeria bio-control,which can specifically recognize bacterial cells and lead to bacterial lysis.The key to antibacterial activities of bacteriophages relies on double stranded DNA-encoded endolysins,the murein enzymes which degrade host cell wall and result in release of phage progeny to the extracellular environment at the end of the phage lytic multiplication cycle.This article reviews the category of Listeria phage endolysins,the mechanism and structural feature of them,and discusses the application area and direction for development of endolysins in the future.
Key words:Listeria; bacteriophage; endolysin; research progress
作者简介:刘珊娜(1984-),女,天津市人,讲师,博士,主要从事食品微生物研究。E-mail:shannaliu@tjau.edu.cn。
基金项目:天津市科技支撑计划项目“基于噬菌体蛋白的李斯特菌快速检测技术及试纸的研发”(14ZCZDNC00003)
收稿日期:2015-08-18
文章编号:1008-5394(2016)01-0062-04
中图分类号:S852.61
文献标识码:A