紫花苜蓿根颈芽越冬期间幼叶细胞超微结构的适应性变化

方强恩，张勃，李宇泊，师尚礼*

(1.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃农业大学草业学院，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，

甘肃 兰州 730070；2. 甘肃农业大学信息科学技术学院, 甘肃 兰州730070)



紫花苜蓿根颈芽越冬期间幼叶细胞超微结构的适应性变化

方强恩1，张勃1，李宇泊2，师尚礼1*

(1.草业生态系统教育部重点实验室，甘肃农业大学草业学院，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，

甘肃 兰州 730070；2. 甘肃农业大学信息科学技术学院, 甘肃 兰州730070)

摘要：为了探讨紫花苜蓿根颈芽越冬抗寒的细胞学机理，本研究以WL168为材料，应用透射电镜技术跟踪观察了根颈芽在自然越冬过程中幼叶细胞的超微结构变化。结果显示，1)在越冬期间，苜蓿根颈芽幼叶细胞超微结构发生了一系列积极适应低温的变化，主要表现为：质膜内陷，中央大液泡分割成多个小液泡，染色质凝集，质体变为月牙形或马蹄状，淀粉粒减少甚至消失，质壁分离等，细胞超微结构经过适应性调整，逐渐提高了根颈芽的抗寒能力。2)根颈芽在越冬期间同时存在白芽与褐芽两种发育状态，其中白芽幼叶细胞对越冬前的降温反应迟缓，直到土壤封冻后才完全形成抗寒结构，但是到了翌年早春，细胞超微结构变化快速，很早便解除抗寒状态，恢复生长。在整个越冬过程中白芽的抗寒性表现出4个不同的发育阶段：抗寒性增强期(10月下旬至12月中旬)，抗寒性保持期(12月下旬至1月中旬)，抗寒性减退期(1月下旬至2月下旬)和抗寒性解除期(3月初至3月中旬)。相反，褐芽幼叶细胞在入冬前对气温下降提前作出了反应，但在翌年早春对气温的回升却反应缓慢，到3月中旬，细胞结构依然保持抗寒特性。越冬期两种根颈芽的存在以及细胞超微结构响应低温的不同步性，是苜蓿越冬抗寒的一种适应策略。

关键词：紫花苜蓿；根颈芽；超微结构；抗寒性

冬季低温是影响紫花苜蓿(Medicagosativa，文中简称苜蓿)生长和地域分布的重要限制因子。近年来由于低温引起的苜蓿冻害使我国苜蓿生产遭受了巨大损失[1]。随着我国苜蓿种植面积不断扩大，能否安全越冬已成为制约我国北方苜蓿草地成功建植和可持续利用的关键问题。目前，关于苜蓿的越冬抗寒机理尚未完全揭示，前人对于该问题的研究主要集中在根部形态及其生理生化特性等方面[2-8]。但是，Schwab和Barnes[9-10]在苜蓿冻害评级标准研究中指出，一旦根颈与根颈芽全部受冻变黑、腐烂，苜蓿便不会返青，即使此时主根可能还是鲜活的。孙启忠等[11]的研究结果也支持这一观点，认为根颈和根颈芽在判断苜蓿越冬中起着决定性作用。可见，保证根颈与根颈芽的安全越冬才是苜蓿抗寒育种与栽培的核心。

一般认为，细胞器与膜结构的稳定性在抗寒锻炼过程中的逐步提高是植物抵御冬季低温胁迫的关键[12]。植物冻害的发生主要是由于低温破坏了细胞的膜系统[13]，而叶器官则是植物最早、最直接感受外界环境变化的部位[14]。Niki[13]研究指出，在低温处理中，叶片中前质体和叶绿体会首先表现出明显的变化。简令成等[15]研究发现，小麦(Triticumaestivum)的抗寒品种进入冬天寒冷季节时，其幼叶细胞中的前质体会发生相互嵌合的拉链现象，而在同样条件下春小麦则不会产生此种现象。Lee等[16]、Ishikawa[17]、Murphy和Wilson[18]、李荣富和王丽雪[19]研究指出，低温会使植物亚细胞结构发生一系列适应性变化，如：质体变为哑铃形，细胞质基质致密度增加，质膜内陷，液泡吞噬作用增强，淀粉粒消失，线粒体内部结构出现空洞等。这些资料表明，迄今为止对于植物冻害发生与越冬抗寒的细胞学机理已经有了较深入的认识，这对植物冻害预防管理和抗寒力鉴定与评价等具有重要的参考意义。但是，目前有关苜蓿根颈芽越冬抗寒机理的研究尚未见报道。本试验选取苜蓿抗寒品种WL168为材料，跟踪观察了根颈芽自然越冬过程中幼叶细胞超微结构的适应性变化，旨在从亚细胞水平阐明苜蓿根颈芽的越冬抗寒机制，以期为苜蓿抗寒育种与寒地栽培技术研究提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料

试验材料为WL168(M.sativa‘WL168’)，种子购自北京正道生态科技有限公司。WL168是近年来由美国牧草资源公司(Forage Genetics International，FGI)培育出的高产、优质、多抗紫花苜蓿品种，秋眠级为2，抗寒级为1。该品种适应性强，在我国东北、内蒙古、新疆、西藏、甘肃和青海等地均可种植，是干旱、寒冷地区的首选品种。

1.2试验地概况及种植管理

试验在甘肃农业大学兰州牧草试验站进行，该地区属温带半干旱大陆性气候，四季分明、光照充足。海拔1517.3 m。年平均降雨量320 mm，年日照时数2474.4 h。田间试验小区面积3 m×3 m，4次重复。2014年4月10日播种。播前结合整地施磷肥750 kg/hm2、氮磷复合肥375 kg/hm2。条播，播种行距30 cm，播量为15 kg/hm2。播种深度1.5～2.0 cm。田间管理包括间苗、中耕除草、适时灌溉。播种当年分别于7月6日、8月25日两次刈割，每次留茬高度均为5 cm。

1.3试验方法

试验在2014年10月至2015年3月间进行。图1为试验期内的日最高温度与日最低温度。取样分4个时期，5次取样：1)秋末低温训练期(10月25日)；2)初冬期(11月25日)；3)冬季严寒期(12月25日，1月25日)；4)早春返青期(3月15日)。采集时间均在上午9:30-12:00。每次采集不同类型芽各5～8个，迅速清洗干净，以备切块固定。

图1　试验期内(2014年10月20日至2015年4月1日)日最高温度与日最低温度Fig.1　The maximum and minimum temperatures in alfalfa growing period from October 20, 2014 to April 1, 2015　箭头表示取样时间。Arrows indicate the dates of collection.

在本试验中，根据芽的发育状态不同，将苜蓿根颈芽划分为褐芽、白芽和绿芽3类。褐芽分布在地下根颈节区约1 cm范围内，芽体很小，由数枚褐色的鳞片包裹；褐芽萌发后冲破鳞片发育为白芽，芽端白色或粉色，芽体大，主要分布在地面以下0～3 cm处；返青期白芽继续发育，露出地面后转变为绿芽，芽端绿色，有2～3枚即将展开的幼叶(图2-11)。

透射电镜样品制备与观察：将清洗干净后的根颈芽立即放在预冷的载玻片上，滴上数滴冷的2.5%戊二醛固定液(固定液用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸缓冲液配制，4℃下保存)，用锋利刀片从芽端幼叶顶部切取0.1 cm×0.2 cm的小块(褐芽需先剥去鳞叶)，迅速放进预冷的2.5%戊二醛固定液中，真空抽气使样品全部沉入底部，然后在4℃下预固定过夜。室温下用磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.0)漂洗3次，每次15 min，再用1%四氧化锇后固定2 h。吸出固定液，加入上述缓冲液漂洗1 h，中间换液4次，之后在50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇(2次)中逐级进行常温脱水，每次20 min，EPON812环氧树脂浸透、包埋、聚合，莱卡EMUC6超薄切片机切片，厚度为70 nm。然后将超薄切片捞于载物网上，经醋酸双氧铀(30 min)和柠檬酸铅(10 min)进行双重染色，在JEM-1230(日本)型透射电镜下进行观察拍照。

2结果与分析

2.1秋末低温训练期根颈芽幼叶细胞的超微结构

从10月25日取样制片中可以看出，苜蓿在秋季低温训练期其白芽幼叶细胞超微结构完整，核位于细胞边缘，核膜清晰，核质分布均匀，核仁大，清晰可见；在细胞周缘围绕细胞核和液泡分布着丰富的质体和线粒体。质体被膜完整，圆形、卵圆形或椭圆形，其中能看到正在分裂增殖的质体(图2-1，白色箭头)，有些质体中晶格状原片层正在发育形成类囊体(图2-3)；胞间连丝为“直型通道”型，明显可见(图2-4)。质膜光滑，尚未发生质壁分离，质膜处有外吐(exocytosis)和内吞(endocytisis)现象发生(图2-4，白色箭头)，这表明白芽幼叶细胞还处在较活跃的生长发育期。但受秋季低温的影响，中央液泡随之发生了适应性变化，具体表现在：液泡表膜不光滑连续，甚至有些区域液泡膜将大量的细胞质小球卷入其内，增加了液泡内浓度(图2-2，白色箭头)；同时在质体中可以看到有淀粉积累(图2-1,2,3,4)。

图2　紫花苜蓿根颈芽秋末与初冬期幼叶细胞超微结构的变化Fig.2　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the late autumn and early winter　1～4：秋末(10月25日)白芽幼叶细胞的超微结构；1：质体丰富，有些质体正在分裂增殖(白色箭头)，核膜清晰，核仁大；2：大液泡正在吞噬细胞质小球(白色箭头)；3：质体中可见晶格状原片层(白色箭头)；4：质体中有淀粉积累，质膜出现小泡(白色箭头)；5～6：秋末(10月25日)褐芽幼叶细胞的超微结构；5：大液泡分割出多个小液泡，核仁边缘模糊；6：核仁消失；7～8：初冬期(11月25日)白芽幼叶细胞的超微结构；7：大液泡正在分割，核向中央靠近，核仁变小；8：质体月牙形，淀粉消失，周围有线粒体聚集；9～10：初冬期(11月25日)褐芽幼叶细胞的超微结构；9：质体马蹄状，液泡稀少，核仁消失；10：质体中积累了大颗粒淀粉，细胞核中染色质发生凝聚；11：苜蓿根颈芽的3种不同类型：褐芽、白芽、绿芽。V：中央大液泡；sV：小液泡；P：质体；Sg：淀粉粒；Cw：细胞壁；M：线粒体；ER：内质网；N：细胞核。下同。1、2、4、9、10图中，标尺=1 μm；7、8图中，标尺=2 μm；3、5、6图中，标尺=0.5 μm。1-4：Cell ultrastructure of white bud in late autumn (Oct. 25)；1：The cell with numerous plastids，nucleus membrane is clear and nucleolus is large，some plastids are dividing to proliferate (white arrow)；2：The large central vacuole is swallowing cytoplasm (white arrow)；3：Plastid with a crystal prolamellar body (white arrow)；4：Starch accumulates in plastid, some vesicles begin to form on plasmalemma (white arrow)；5-6：Cell ultrastructure of brown bud in late autumn (Oct. 25)；5：The large central vacuole is segmented into multiple small vacuoles，the edge of nucleolus becomes blur；6：Nucleolus is disappeared；7-8：Cell ultrastructure of white bud in early winter (Nov. 25)；7：The large central vacuole is segmented，nucleus closes to the central, nucleolus becomes smaller；8：Starch grain is disappeared，plastids become crescent-shaped which mitochondria is clustered around；9-10：Cell ultrastructure of brown bud in early winter (Nov. 25)；9：Plastids become horseshoe-shaped，vacuole is rare，nucleolus is disappeared；10：A great amount of starch accumulate in plastid，chromatin is agglutinated；11：Showing three types of crown bud：brown bud，white bud and green bud．V：Large central vacuole；sV：Small vacuole；P：Plastid；Sg：Starch grain；Cw：Cell wall；M：Mitochondrion；ER：Endoplasmic reticulum；N：Nucleus.The same below. Scale bars=1 μm in 1，2，4，9，10；2 μm in 7，8；0.5 μm in 3，5，6.

褐芽与白芽相比，质体小，片层结构较少，其中看不到淀粉粒(图2-5,6)；大液泡已经开始分割出很多小液泡；核仁边缘变得模糊，甚至有些细胞核仁消失(图2-5,6)。在质膜处亦然有吞吐现象发生，仍未发生明显的质壁分离(图2-6)。

2.2初冬期根颈芽幼叶细胞的超微结构

在初冬期(11月25日)，最低气温已经降至零度以下(图1)，地面即将封冻，此时通过透射电镜看出，白芽幼叶细胞中细胞壁较前期增厚，大液泡已经分割出了许多小液泡，并向质膜靠近(图2-7)。在细胞边缘分布的液泡周围整齐地环绕着数量丰富的内质网(图2-8)。质体变为变形虫状或月牙形，周围有线粒体分布(图2-7,8)。核移到了细胞中央附近，核仁变小，并受低温影响发生出芽现象(图2-7)，甚至有些细胞已分裂出两个核仁(图2-8)。此期质膜依然光滑，未发生质壁分离。质体中淀粉消失(图2-7,8)。

褐芽对初冬低温的适应性变化较白芽更为强烈，细胞核中染色质发生不同程度的凝聚(图2-10)。在核周围聚集着多个体积较大的淀粉粒(图2-10)，有些细胞核仁依然消失，质体变为马蹄形，淀粉水解(图2-9)。大液泡完全消失，小液泡数量减少，体积近等大，在细胞内无规律地分布(图2-10)。

2.3冬季严寒期根颈芽幼叶细胞的超微结构

12月25日，地面已经封冻约20多天，天气转入冬季严寒期。从透射电镜看出，白芽幼叶细胞中大液泡已经全部分割为体积近等大的小液泡，液泡总数量减少，细胞质变得浓密(图3-1,2)；细胞核膜周缘分布有少量异染色体，有些细胞中核仁消失(图3-2)；在细胞中靠近质膜的区域还能清晰地看到高尔基体及其产生的大量高尔基小泡(图3-3)，质膜内陷呈波状，质壁分离现象开始发生，由此隔断了胞间连丝(图3-4)。质体中片层结构清晰(图3-3)。

此时，褐芽幼叶细胞中细胞质更加浓密，液泡很少(图3-6,7,8)，质体中含有体积较大的淀粉粒，且电子致密度高(图3-7)，线粒体数量增加，质壁分离现象明显(图3-7,8)。

到1月25日，白芽幼叶细胞中液泡开始大量吞噬细胞质小泡和细胞器，体积变大，小液泡正在减少或已消失(图3-9,10,11,12)；质体中淀粉积累量增多，淀粉粒的电子致密度不一(图3-9,10)，有些细胞中还产生了复合造粉体(图3-10)；线粒体数量丰富(图3-11)。此时褐芽中液泡的吞噬和融合现象更明显，液泡通过吞噬作用融合吸收了细胞质小泡(图3-13,14)，增加了膜面积，另外通过质膜的内吞作用从外界获得水分和能量。质体中淀粉粒的电子致密度增加，复合造粉体围绕细胞核分布，在造粉体周围及其邻近区域有内质网清晰可见(图3-15,16)。

2.4早春返青期根颈芽幼叶细胞的超微结构

在早春返青期(3月15日)，天气回暖，土壤解冻，大量白芽萌发出土发育为绿芽。此时绿芽幼叶细胞质膜已恢复至光滑状态，质壁分离现象消失(图4)。液泡通过自体吞噬和质膜内吞作用(图4-4)，使之不断扩大，形成中央大液泡。细胞核从中央移至质膜附近；质体发育为叶绿体，类囊体排列整齐，片层结构清晰，其内很少再有淀粉积累。有些叶绿体正通过横缢分裂进行增殖，周围分布有丰富的线粒体(图4-1)；在原维管组织细胞中，装载有细胞壁材料的高尔基小泡被输送到质膜，通过外吐作用将其内部物质释放到质膜外的细胞壁中(图4-3)。由于质壁分离现象的消失，胞间连丝也恢复功能，为细胞间的物质交换提供通道(图4-6，白色箭头)。幼叶维管束中的伴胞被修饰成传递细胞(transfer cell)，通过增加质膜表面积增强细胞间物质的运输功能(图4-5)。

与绿芽相比，此期褐芽发育变化比较缓慢，液胞仍然进行着吞噬和水合(图4-7,8,9)，部分细胞核仁尚未出现(图4-9)，质体幼小，数量少，零星分布在细胞质中(图4-7,8)；质膜光滑，质壁分离现象消失；细胞中淀粉粒完全水解，造粉体消失。在质膜周围分布有数量丰富的内质网(图4-9)。

图3　紫花苜蓿根颈芽严冬期幼叶细胞超微结构的变化Fig.3　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the deep winter　1～4：严冬期(12月25日)白芽幼叶细胞的超微结构；1：大液泡消失，核膜周缘分布少量异染色体(白色箭头)；2：核仁消失；3：质体中片层结构清晰，质体周围有高尔基体分布；4：质膜内陷呈波状；5～8：严冬期(12月25日)褐芽幼叶细胞的超微结构；5：淀粉粒电子致密度高；6：核仁消失，液泡稀少；7：线粒体数量增加；8：发生质壁分离；9～12：严冬期(1月25日)白芽幼叶细胞的超微结构；9：淀粉数量丰富；10：出现造粉体(白色箭头)；11：线粒体数量增加；12：液泡吞噬了大量细胞质小泡和细胞器(白色箭头)；13～16：严冬期(1月25日)褐芽幼叶细胞的超微结构；13～14：液泡开始吞噬、融合，体积增大(白色箭头)；15：淀粉粒体积大，电子致密度高，周围分布大量内质网；16：很多造粉体围绕在细胞核周围。Pm：质膜；Ga：高尔基体。1、2、6、9、11、14、15图中标尺=1 μm；5、12、16图中标尺=2 μm；4、7、8、10、13图中标尺=0.5 μm；3图中标尺=0.2 μm。1-4：Cell ultrastructure of white bud in the deep winter (Dec. 25);1：The large vacuole is disappeared，a small amount of heterochromosome is distributed at the edge of the nuclear membrane (white arrow)；2：Nucleolus is disappeared；3：Plastid lammelar is clear, Golgi apparatus occurs around plastid；4：Plasmalemma is invaginated, looked like a wavy；5-8：Cell ultrastructure of brown bud in the deep winter (Dec. 25)；5：The starch grains with great electronic density；6：Nucleolus is disappeared，vacuole is rare；7：The number of mitochondria is increased；8：Plasmolysis occurs in this period；9-12．Cell ultrastructure of white bud in the deep winter (Jan. 25 of next year)；9：Numerous starch grain accumulates in the plastid；10：Amyloplast emerges (white arrow)；11：The number of mitochondria is increased；12：Vacuoles have swallowed up a large number of vesicles and organelles (white arrow)；13-16：Cell ultrastructure of brown bud in the deep winter (Jan. 25 of next year)；13-14：Vacuoles begin to devour each other and amalgamate (white arrow)；15：Starch grains with larger volume and greater electronic density，numerous endoplasmic reticulum occurs around the starch grain；16：Many amyloplasts appear close to nucleus．Pm：Plasmalemma；Ga：Golgi apparatus．Scale bars=1 μm in 1，2，6，9，11，14，15；2 μm in 5，12，16；0.5 μm in 4，7，8，10，13；0.2 μm in 3．

图4　紫花苜蓿根颈芽早春期幼叶细胞超微结构的变化Fig.4　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the early spring　1～6：早春期(3月15日)绿芽幼叶细胞的超微结构；1：中央大液泡形成，细胞核被挤到边缘，叶绿体正在分裂增殖(白色箭头)；2：由质体发育而来的叶绿体中类囊体排列整齐，周围分布有丰富的线粒体；3：高尔基小泡(白色箭头)被运输到细胞壁中；4：液泡正在吞噬；5：幼叶维管束中伴胞被修饰成传递细胞；6：胞间连丝清晰可见(白色箭头)；7～9：早春期(3月15日)褐芽幼叶细胞的超微结构；7：质体数量稀少，造粉体消失；8：大液泡尚未完全形成，液泡仍进行着吞噬与融合；9：质膜周围有丰富的内质网。Ch：叶绿体。1、2、4、5、6、7、9图中标尺为1 μm；3和8图中标尺为0.5 μm。1-6：Cell ultrastructure of green bud in early spring (Mar.15 )；1：The large central vacuole has been formed，nucleus is pushed to the edge of cell，chloroplasts are proliferating (white arrow)；2：Thylakoids orderly arrange in chloroplast，numerous mitochondrions is distributed around the thylakoid；3：Golgi vesicles (white arrow) are transported to the cell wall；4：Vacuoles are swallowing up each other；5：Transfer cell occurs in the vascular bundles of young leaf；6：Plasmodesmata is clearly visible (white arrow)；7-9：Cell ultrastructure of brown bud in early spring (Mar.15 )；7：Plastid is disappeared，amyloplast becomes rare；8：The large central vacuole is not yet fully formed，vacuoles are still swallowing each other；9：Numerous endoplasmic reticulum is distributed close to the plasmalemma．Ch：Chloroplast．Scale bars=1 μm in 1，2，4，5，6，7，9；0.5 μm in 3 and 8．

3讨论

3.1根颈芽幼叶细胞超微结构对秋冬低温的适应

从上述研究结果可以看出，苜蓿根颈芽在越冬期间，幼叶细胞中质膜、质体、液泡、细胞核等超微结构发生了明显的变化。一般认为，质膜是寒害或冻害损伤的最初部位，为了抵抗低温冻害，质膜在抗寒锻炼或低温胁迫时会产生抗寒性的适应性变化[20]。在本文中，根颈芽幼叶细胞在秋末低温训练期，质膜通过内陷或外凸(图2-4,6)形成小泡，这些小泡不但能将细胞内物质外排到质膜和细胞壁之间，防止质壁分离处产生冰冻[20]，还能克服质膜对大分子物质通透性的限制，增加细胞质的浓度，降低冰点，最终提高植物抗寒性[21]。可见，秋冬低温条件下苜蓿根颈芽细胞中质膜内陷是一种积极的适应行为。

本研究发现，在初冬期(11月25日)苜蓿根颈芽细胞壁较前一时期显著增厚(图2-7,8,9,10)。简令成和王红[22]分析指出，低温锻炼下植物细胞壁之所以会发生次生加厚和木质化，是因为低温锻炼期质膜会频频出现外吐现象，细胞通过质膜的外吐作用将细胞质小泡(包括小液泡)中包含的大分子物质释放到质膜外，参与细胞壁的构建，以增加细胞壁的坚固性。这一适应性变化可以防止植物细胞因冰冻失水而造成机械性损害。在初冬低温锻炼过程中，冬油菜(Brassicanapus)[23]、冬小麦[24]、桑树(Morusbombciz)[25]、云杉(Piceaasperata)[26]等植物细胞壁都表现出了相同的适应性变化。Rajashekar和Lafta[27]研究指出，抗寒锻炼加富了细胞壁结构成分胼胝质、纤维素、半纤维素和果胶质的积累，尤其是木质素和伸展蛋白(extensin)在细胞壁中的沉积，后二者能大大增强细胞壁的坚硬度，而且，细胞壁中伸展蛋白的沉积可以提高细胞的抗冻性[28]。

液泡是一种水相体系，因而也是发生冷害的最危险部位，对低温冰冻敏感，极易受低温胁迫。本研究结果显示，苜蓿根颈芽幼叶细胞中液泡是所有膜系统中对秋季低温最敏感的。从10月25日采样中看出(图2-2)，此时线粒体、质体、质膜等均结构完整清晰，唯有液泡表膜出现较大变化，形状变得不规则，膜发生反卷和内陷，形成吞噬泡，把部分细胞质和细胞器吞噬到液泡中，在液泡中出现了多层膜结构或小泡(图2-6)。液泡的内吞作用被认为与植物的抗寒性和抗冻锻炼密切相关[29-30]。Sangwan等[31]认为，由液泡膜内吞而进入液泡的细胞质和膜状结构，经有关酶降解后可变为蛋白质及RNA等大分子物质。韩善华等[32]通过组化分析发现，在冬季沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)叶肉细胞中，液泡内含物含有大量的脂类物质。由此分析，苜蓿根颈芽液泡膜大量内吞，有助于提高液泡中的液体浓度，这样可以减慢水分向细胞质渗透的速度，降低冰点。此外，被内吞的膜状物质降解后还可作为合成膜的原料贮存在液泡中，一旦液泡膜受到损伤和破坏，它就能使液泡膜迅速修复和很快合成[32]。因此，苜蓿根颈芽幼叶细胞中出现液泡膜的大量内吞，并非偶然现象，很可能与其抗寒性的形成有关。

细胞核是DNA复制和DNA转录的特区，是有机体生长和发育的控制中心，因而它必然也是植物对逆境反应和适应的控制中心。低温下保证细胞核的存活对于维持植株的存亡至关重要。Ritali和Ashworth[33]认为，木本植物木射线薄壁细胞在冷胁迫中，染色质会发生凝聚。但Jian等[34]指出，冬小麦在越冬过程中染色质的分布没有发生聚集现象。本研究中，在初冬期和冬季严寒期，褐芽和白芽细胞核中染色质分别发生了不同程度的凝聚(图2-10，图3-1)。一般认为，染色质在冬季发生暂时性凝集是遏制DNA转录和mRNA新合成、诱导生理休眠的一种内在机制[22]。

质体是和糖类合成与贮藏密切相关的细胞器。当受外界环境影响时，质体常发生变形，多变为哑铃形、变形虫状、马蹄形或环形等[35]。目前关于质体变形的原因，存在多种解释。有研究认为，质体变形是质体发育过程中的正常现象[36]，它只是一种不同形态类型的造粉体[35]。杨涛等[37]认为，哑铃形质体的出现表明质体正以分裂的方式来增加数目。还有报道指出，变形的质体可能承担着分泌功能[38]。据本研究观察，在秋末低温训练期(10月25日)，苜蓿根颈芽幼叶细胞中质体被膜完整，卵圆形或椭圆形，有淀粉粒积累其中(图2-2,3,4)。但到初冬期(11月25日)，质体变为月牙状或马蹄形(图2-7,8)，此时其中积累的淀粉粒明显减少甚至消失，并且质体周围有线粒体聚集，由此推测，质体变形可能是细胞分解淀粉粒的一种表现，聚集的线粒体可为其提供能量。低温下质体通过分解淀粉粒来增加细胞质中的可溶性糖浓度[22]，从而提高植株的抗寒性。在许多试验中均观察到，逆境胁迫可导致线粒体数量增加[39-40]。低温虽然一定程度上降低了线粒体和质体的活性，但它们通过增加数量来保证能量供给，因此，线粒体数量的增加可以认为是对低温等逆境作出的一种积极的、补偿性的反应。

3.2苜蓿根颈芽自然越冬过程中抗寒性的变化

上述分析表明，根颈芽在秋冬低温锻炼中(10月至11月)，细胞内质膜、液泡、细胞核与质体的结构与功能经过积极的适应性变化，逐步增强了苜蓿的越冬抗寒力。到12月25日，时值严冬，从该期取样中可以看到(图3-4)，此时苜蓿根颈芽幼叶细胞发生了质壁分离。大量研究结果表明，多年生植物在低温胁迫下所发生的质壁分离，是保证自身安全越冬的一种适应机制[22]。质壁分离发生时，质膜通过内陷形成波浪状结构，以此增加质膜量，这样可以防治冰冻脱水后细胞收缩对质膜产生损伤，从而有效避免在严冬季节发生冻害。有报道指出[20]，细胞质壁分离还能使胞间连丝中断，共质体连续性被破坏，植株停止生长或生长减弱，进入暂时休眠。

据此分析，通过前期的自然低温锻炼，到严冬时期苜蓿根颈芽细胞内生理活动已经减弱至极低点，以休眠状态抵御冻害。但是，从试验结果看，芽休眠维持时间并不长，到1月下旬，细胞又开始变得活跃起来，主要表现在：小液泡之间开始融合、变大；有些质体几乎完全被淀粉粒所充满，转变为造粉体(图3-10,15,16)，在造粉体周围可看到环绕着较多的内质网(图3-15)。简令成和王红[22]认为，发育中的造粉体会与内质网形成一种复合体(amyloplast-ER complex)，这是碳水化合物代谢和淀粉粒合成的联合体系，内质网可能为造粉体起着物质运输通道的作用。由此表明，在1月下旬苜蓿根颈芽细胞的抗寒结构特征已开始发生变化，造粉体开始形成，为返青期根颈芽出土生长作能量供给上的准备。

3月中旬，气温回升，此时大量白芽萌发出土发育为绿芽，绿芽幼叶细胞的质壁分离现象消失；液泡通过自体吞噬作用形成中央大液泡；质体发育为叶绿体；胞间连丝恢复功能；幼叶维管束中出现传递细胞(图4)。以上特征均表明，在3月中旬，白芽已完全恢复生长，幼叶细胞结构已不再表现抗寒特征。但此期褐芽发育比较缓慢，细胞超微结构仍然保持抗寒性，如：液胞间仍进行着吞噬和水合，细胞内还未完全形成中央大液泡；核仁缺失，质体幼小等。

由以上分析可以看出，苜蓿自然越冬过程中白芽的抗寒性明显表现出了4个不同的发育阶段：抗寒性增强期(10月下旬至12月中旬)；抗寒性保持期(12月下旬至1月中旬)；抗寒性减退期(1月下旬至2月下旬)；抗寒性解除期(3月初至3月中旬)。但是，褐芽在本试验开始时(10月25日)就已表现出了抗寒性，而且到试验结束时(3月15日)抗寒性还未完全解除，因此关于褐芽抗寒性的完整发育过程还需进一步研究。

3.3褐芽和白芽对冬季低温的适应性差异

在西北地区，霜降之后，即10月底至11月中旬，苜蓿地上部分因冻害而逐渐枯死，其越冬主要依靠地下根颈芽[41]。因此，根颈芽能否安全越冬，直接决定苜蓿的越冬率和翌年草产量。前人一直仅把苜蓿地下白色或粉红色的芽视为根颈芽[42-43]。但根据本研究观察，发现苜蓿越冬前根颈芽存在着两种发育状态：一类芽在土壤封冻前已经在地下萌发，鳞叶枯落，芽体较长，白色或粉红色(文中记为白芽，图2-11)；另一类芽则始终被褐色鳞叶包裹，处于潜伏状态(文中记为褐芽，图2-11)。褐芽虽然芽体小，萌发迟，但其数量庞大。进一步观察发现，在正常情况下，褐芽不会出土生长，当地上茎叶和正在发育的白芽遭到损伤而失去发育能力时，褐芽会发育为白芽，萌发出土形成地上枝。本试验通过观察比较白芽和褐芽在越冬期间幼叶细胞超微结构的变化，发现两种芽在越冬过程中具有不同的适应特点：在秋末低温锻炼期，白芽细胞超微结构完整，核仁大，核膜清晰，质体和线粒体丰富，质体正在分裂增殖，表明此时期细胞生长代谢仍较活跃，但褐芽此时已经对低温变化作出了反应，表现在：核仁边缘模糊或者核仁消失，大液泡分割出很多小液泡。在初冬期，白芽细胞中液泡开始分割，质体变形，核仁变小，淀粉消失，此时褐芽反应更为强烈，细胞核中染色质出现轻微凝聚，大液泡完全消失；到严冬期，白芽和褐芽均出现质壁分离。在早春返青期，天气回暖，白芽萌发出土发育为绿芽，幼叶细胞内中央大液泡已形成，质体发育为叶绿体，质壁分离消失，出现传递细胞，细胞间物质的运输功能增强。相比之下，此时褐芽细胞中，小液泡间仍进行着吞噬和水合，中央大液泡尚未形成，但淀粉粒已完全水解，核仁缺失，质体数量少，表明细胞生长缓慢，仍然保持抗寒特性。

综上所述，苜蓿根颈芽是以白芽和褐芽两种不同的发育状态越冬的，而且，两种芽在越冬期间表现出不同的适应特性：白芽对越冬前气温下降反应迟缓，直到土地封冻后芽生长才结束，但它对返青期的气温回升反应敏感，很早便开始萌发生长。相比之下，褐芽入冬前能够对低温提前做出反应，以适应随后到来的冬季严寒；但在早春返青时，对气温的回暖变化反应缓慢。一般认为，北方地区早春气温先暖后冷的“倒春寒”是导致苜蓿冻害发生的主要原因[1]，褐芽对早春气温变化不敏感的这一特点，正好可以避免倒春寒的危害。可见，苜蓿越冬期两类根颈芽的存在，既保证了返青期的高产，又可以预防冬季严寒和倒春寒的危害，保存生长点，这正是苜蓿越冬抗寒的一种适应策略。

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Adaptive changes in the young leaf cell ultrastructure of crown buds inMedicagosativa(Leguminosae) during overwintering

FANG Qiang-En1, ZHANG Bo1, LI Yu-Bo2, SHI Shang-Li1*

1.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,SinoU.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China； 2.CollegeofInformationScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:In order to explore the cytological mechanism of cold resistance in alfalfa crown buds during winter, a study of ultrastructural changes in young leaf cells of crown buds in the alfalfa variety ‘WL168’ was conducted by means of TEM. The results showed that: 1) a series of active changes in cell ultrastructure adapted to cold temperature take place during overwintering. The major changes included plasmalemma invaginations, the large central vacuole segmentation into multiple small vacuoles, chromatin condensation, plastid becoming crescent or horseshoe-shaped, starch grains depletion or even disappearance and plasmolysis. The capacity for cold resistance in buds was improved gradually by these adaptive adjustments of cell ultrastructure. 2) Two kinds of crown buds were found in winter: white bud and brown bud. These two kinds have different cellular growth states. The white bud cells had a slow response to cooling before winter and did not fully form specialized structures for winter hardiness until soil freezing, but they regrew quickly after cold resistance release in early spring. The cold resistance development of white buds during overwintering went through 4 phases: enhanced phase (late Oct-mid-Dec), maintenance phase (late Dec-mid-Jan), decline phase (late Jan-late Feb) and termination phase (early Mar-mid-Mar). In comparison, brown bud cells responded earlier to low temperatures before winter but more slowly to the warming of temperatures in spring. By mid-March, the cellular structure of brown buds still maintained their cold tolerance. The coexistence of brown and white buds during winter, whose cell ultrastructure changes asynchronously in response to low temperature, could be an adaptive strategy of alfalfa to cold stress.

Key words:alfalfa (Medicago sativa)； crown bud； ultrastructure； cold resistance

*通信作者

Corresponding author. E-mail: shishl@gsau.edu.cn

作者简介：方强恩(1980-)，男，甘肃天水人，讲师，博士。E-mail:fangqen@163.com

基金项目：国家现代牧草产业技术体系-栽培与草地管理(CARA-35)，农业部牧草种质资源保护与利用(NB2130135)和甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金(GSAU-STS-1228)资助。

收稿日期：2015-09-22；改回日期：2015-11-16

DOI：10.11686/cyxb2015443

http://cyxb.lzu.edu.cn

方强恩，张勃，李宇泊，师尚礼. 紫花苜蓿根颈芽越冬期间幼叶细胞超微结构的适应性变化. 草业学报, 2016, 25(3): 96-107.

FANG Qiang-En, ZHANG Bo, LI Yu-Bo, SHI Shang-Li. Adaptive changes in the young leaf cell ultrastructure of crown buds inMedicagosativa(Leguminosae) during overwintering. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 96-107.