重组菌丝霉素发酵培养基筛选及重组菌丝霉素在断奶仔猪上的应用

李　延　万　津　晨　光　陈代文　余　冰　何　军*

(1.四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，成都611130；

2.成都华罗生物科技有限公司，成都610062)



重组菌丝霉素发酵培养基筛选及重组菌丝霉素在断奶仔猪上的应用

李延1,2万津1晨光2陈代文1余冰1何军1*

(1.四川农业大学动物营养研究所，动物抗病营养教育部重点实验室，成都611130；

2.成都华罗生物科技有限公司，成都610062)

摘要：本试验旨在对重组菌丝霉素发酵培养基进行优化筛选，并研究饲粮中添加重组菌丝霉素对断奶仔猪生长性能、养分消化率和肠道微生物菌群的影响。试验利用30 L发酵罐对毕赤酵母基因工程菌(PPle)进行液体发酵，采用分批-补料式发酵工艺，比较低盐、基础甘油和基础可溶性淀粉3种不同培养基对重组菌丝霉素分泌表达的影响。动物试验选用30头24日龄健康的“杜长大”断奶仔猪，按体重一致原则随机分配到5个组：对照组(CON组，基础饲粮)、硫酸黏菌素组(CS组，基础饲粮+0.3%硫酸黏杆菌素)、抗菌肽组(AP组，基础饲粮+0.2%重组菌丝霉素)、微生态制剂组(PB组，基础饲粮+0.1%微生态制剂)和联合应用组(PPB组，基础饲粮+0.2%重组菌丝霉素+0.1%微生态制剂)，试验期21 d。结果表明：发酵到114 h，低盐组、基础甘油组和基础可溶性淀粉组菌体湿重达到最高，分别为450、402、277 g/L。发酵114 h，测得发酵上清液蛋白总浓度低盐组0.38 g/L、基础甘油组3.94 g/L、基础可溶性淀粉组5.63 g/L。动物试验表明，与CON组相比，CS组和AP组显著提高了平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG)，显著降低了料重比(F/G)(P<0.05)。与CON组相比，CS组和AP组有降低腹泻率的趋势(0.05

关键词：重组菌丝霉素；抗菌肽；生长性能；养分消化率；断奶仔猪

近50年来，抗生素用于动物生产，给畜牧生产者带来了巨大的经济效益，但近20年来，随着科学技术的发展和生活水平的提高，人们逐渐认识到抗生素会在畜产品中残留及产生抗药性等负面作用。因此，寻求绿色、高效、无污染和无残留的抗生素替代品显得尤为迫切。近年来，抗菌肽作为一种潜在的饲用抗生素替代品越来越受到研究者的青睐。Schneider等[1]报道，在2005年通过分析腐生子囊菌分泌蛋白的cDNA库，找到了与动物防御素相似的片段，并命名为菌丝霉素。金黄色葡萄球菌在保育猪舍发病率高达15%，仔猪感染后死亡率达到70%，这对畜牧业生产带来了巨大的危害[2]。与此同时，抗生素的滥用也给养殖业带来了严重的危害。目前国内外都在寻找替代抗生素的新型饲料添加剂。本实验室在前期的研究中将菌丝霉素基因克隆进入毕赤酵母中，得到一株毕赤酵母基因工程菌(PPle)，其分泌的重组菌丝霉素可用于金黄色葡萄球菌感染的预防和治疗。研究表明，重组菌丝霉素无细胞毒性，无溶血性，可作为一种潜在的非抗生素类饲料添加剂使用[3]。许多动物防御素类抗菌肽需要在很低的离子浓度情况下才能发挥其抗菌作用，而菌丝霉素作为被筛选得到的首例真菌类防御素，在生理离子浓度下就能发挥杀菌作用，且对金黄色葡萄球菌和猪链球菌等革兰氏阳性菌有着很强的抑制作用[1]。目前菌丝霉素主要从天然微生物中获得，产量低且分离纯化困难。本实验室在前期研究中成功构建了一株能分泌重组菌丝霉素的PPle，不仅实现了高水平分泌表达，且表达产物纯度较高。为进一步降低其生产成本，本试验在30 L液体发酵罐中比较了低盐等3种不同培养基对PPle菌丝霉素表达水平的影响；在此基础上，评估了重组菌丝霉素在断奶仔猪上的应用效果，以期为抗菌肽重组菌丝霉素在饲料工业上的推广应用积累资料。

1材料与方法

1.1试验材料

重组菌丝霉素基因工程菌PPle，本实验室构建。

重组菌丝霉素：粉状制剂，由本试验发酵制得，有效含量为30 mg/kg。

硫酸黏菌素：粉状制剂，有效含量为20 mg/kg，购自四川恒通公司。

微生态制剂：粉状制剂，枯草芽孢杆菌≥109CFU/g，地衣芽孢杆菌≥109CFU/g，活菌总数≥2×109CFU/g，购自蔚蓝生物集团。

1.2发酵罐培养与产物检测

1.2.1发酵罐培养

发酵罐灭菌：将培养基倒入发酵罐中加水至20 L进行灭菌，升温至120 ℃灭菌30 min，待冷却至30 ℃后设置为恒温，用氨水溶液将pH调至5.5，通过空气压缩机通入空气，打开搅动阀。

发酵罐接种：采用火焰接种法，将2级种子接种到发酵罐中。

碳源补料：先预培养2 h，根据溶氧(DO)值来控制碳源的流加速度，当溶氧值升高时，碳源流加速度应当提高，反之亦然。

甲醇诱导：当碳源消耗殆尽后，溶氧值会迅速升高，此时进行碳源饥饿1 h。然后采用变速流加的补料方式。当pH变化不大的时候，开始诱导。诱导过程应通过开度和周期的调节将溶氧控制在在20%～30%，确保甲醇流加量和消耗量相平衡。

甲醇补料速度：共3个阶段，34、51、68 mL/h。

1.2.2发酵产物检测

发酵结束后，离心收集发酵上清液进行纯化。将含有菌丝霉素的发酵上清液通过His亲和层析纯化，-20 ℃短期贮存备用。采用考马斯亮蓝法检测发酵上清液总蛋白，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组菌丝霉素的表达效果。将金黄色葡萄球菌ATCC 25923接种于50 mL MHB培养基中，37 ℃摇床培养过夜；将事先准备好灭菌的42 ℃ MHA培养基，倒入培养皿中，待培养基凝固后，涂抹上述菌液200 μL,并在无菌孔中依次加入经2 500 U胃蛋白酶、甘氨酸-氢氧化钠(glycine-NaOH)缓冲液(pH=10.0)和pH为2.0的甘氨酸-盐酸(glycine-HCl)缓冲液处理4 h后的重组菌丝霉素，将平板正面向上37 ℃培养18～24 h，观察抑菌效果。

1.3动物试验设计

试验选用30头24日龄健康“杜长大”(DLY)的断奶仔猪，按照体重一致原则分配到5个组：对照组(CON组，基础饲粮)、硫酸黏菌素组(CS组，基础饲粮+0.3%硫酸黏杆菌素)、抗菌肽组(AP组，基础饲粮+0.2%重组菌丝霉素)、微生态制剂组(PB组，基础饲粮+0.1%微生态制剂)和联合应用组(PPB组，基础饲粮+0.2%重组菌丝霉素+0.1%微生态制剂)，每个组6个重复，每个重复1头猪，试验期21 d。于试验第21天空腹称重，并记录日采食量；并于试验第17～21天，采用内源指示剂收粪法，进行消化试验。

1.3.1试验饲粮

试验采用玉米-豆粕型饲粮作为基础饲粮，参考NRC(2012)猪营养需要配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.3.2饲养管理

本试验在四川农业大学(动物营养所科研试验基地仔猪舍)进行。试验前对猪舍进行彻底的消毒，并清洗料槽、水槽。对试验仔猪进行常规免疫与驱虫。每日饲喂4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，少喂勤添，自由饮水，每个处理饲养管理条件一致。圈舍内温度保持在24～26 ℃，相对湿度控制在70%～85%。保持圈舍清洁，环境舒适，每天晚上结算余料并做相应记录。

表1　基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)维生素预混料为每千克饲粮提供The vitamin premix provided the following per kg of the diet：VA 6 000 IU，VE 12.5 UI，VD3400 IU，VK32 mg，VB10.8 mg，VB62.4 mg，VB26.4 mg，VB1212 μg，叶酸 folic acid 0.2 mg，泛酸 pantothenic acid 10 mg，烟酸 nicotinic acid 14 mg。

2)矿物元素预混料为每千克饲粮提供The mineral premix provided the following per kg of the diet：Fe (as ferrous sulfate) 100 mg，Zn 100 mg，Cu (as copper sulfate) 6 mg，I (as ferrous sulfate) 0.3 mg，Mn (as manganese sulfate) 4 mg，Se (as sodium selenite) 0.35 mg。

3)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4样品采集与分析

试验期间记录仔猪的采食量，并计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

在试验的第17～21天样品收集粪便，共4 d。将收集的粪便经充分混合，置于烘箱，60～65 ℃烘2 d。样品干燥后用粉碎机粉碎，过40目筛，收集到样品袋中，用于测定养分(干物质、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分、能量、钙、磷)表观消化率。

每天记录腹泻情况，并计算腹泻率。

腹泻率(%)=100×腹泻头数×腹泻天数/

(试验头数×试验天数)。

粪便中DNA的提取按照Omega公司的DNA提取试剂盒的操作方法进行，随后进行荧光定量PCR检测，测定回肠和盲肠食糜中的总菌(total bacteria)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、芽孢杆菌(Bacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)和大肠杆菌(Escherichiacoli)的数量。引物和探针序列(表2)参考Qi等[4]。

1.5数据统计与分析

所有试验结果均用平均值和标准误表示，先用Excel 2010作初步统计，再采用SAS 9.1软件进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较和显著性分析检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，0.05

2结果

2.1不同培养基对重组毕赤酵母生长和重组蛋白分泌的影响

由图1可知，菌体在进罐18 h内增长非常缓慢。不同培养基对菌体生长过程有不同的影响。前期低盐组菌体湿重增长速率较基础甘油组和基础可溶性淀粉组更快。发酵到114 h，低盐组、基础甘油组和基础可溶性淀粉组菌体湿重达到最高，分别为450、402、277 g/L。菌体生长在98 h后进入稳定期。发酵114 h，即诱导72 h后开始放罐。取菌液离心收集上清液后，做上清液总蛋白检测，测得低盐组上清液蛋白总浓度0.38 g/L，基础甘油组3.94 g/L，基础可溶性淀粉组5.63 g/L。综合发酵曲线数据，最终选择基础甘油组发酵上清液进行SDS-PAGE检测以及体外抑菌试验。

由图2可知，基础甘油组诱导24、48、72、96 h后，均在41 ku左右出现了特异性条带。

表2　荧光定量PCR特异性引物序列及探针

图1　不同培养基对毕赤酵母基因工程菌生物量的影响

2.2重组菌丝霉素的体外抑菌效果

由图3可知，重组菌丝霉素经glycine-HCl缓冲液(pH=2.0)、glycine-NaOH缓冲液(pH=10.0)和2 500 U的胃蛋白酶处理4 h后，其对金黄色葡萄球菌仍有强烈抑菌效果。其中胃蛋白酶处理之后抑菌效果与对照组相似，表明该重组菌丝霉素对胃蛋白酶耐受能力较强，进入胃后不易被降解，稳定性较好。

M：标记，1:诱导96 h，2:诱导72 h，3:诱导48 h，4:诱导24 h。

M：marker，1: induction 96 h， 2: induction 72 h， 3: induction 48 h， 4: induction 24 h.

图2重组菌丝霉素SDS-PAGE图片

Fig.2SDS-PAGE picture of the recombinant

plectasin

2.3重组菌丝霉素对断奶仔猪生长性能的影响

如表3所示，与CON组相比，CS组和AP组显著增加了ADFI(P<0.05)。CS、AP和PPB组与CON组相比极显著提高了ADG(P<0.01)，以及极显著降低了F/G(P<0.01)。与CON组相比，CS组和AP组有降低腹泻率的趋势(0.05

3:胃蛋白酶处理，4:甘氨酸-盐酸缓冲液处理，5:甘氨酸-氢氧化钠缓冲液处理，6:对照。

3: pepsin treatment, 4: glycine-HCl buffer treatment, 5: glycine-NaOH buffer treatment, 6: control.

图3重组菌丝霉素抑菌图(处理4 h)

Fig.3Antibacterial picture of the recombinant plectasin

(treatment for 4 h)

2.4重组菌丝霉素对断奶仔猪养分消化率的影响

由表4可知，与CON组和AP组相比，其余3

个组显著提高了粗灰分的表观消化率(P<0.05)，但CON组和AP组之间差异不显著(P>0.05)。PB组磷的表观消化率极显著高于其余4个组(P<0.01)。CON组粗脂肪的表观消化率显著低于其余4个组(P<0.05)。CON组在能量和干物质的表观消化率上有低于其余4个组的趋势(0.05

2.5重组菌丝霉素对断奶仔猪肠道微生物菌群的影响

从图4可知，与其余各组相比，AP组显著提高了回肠食糜双歧杆菌的数量(P<0.05)，PB组显著提高了回肠食糜乳酸杆菌的数量(P<0.05)。

由图5可知，与CON组相比，AP组显著降低了盲肠食糜中大肠杆菌的数量(P<0.05)，PB组显著提高了盲肠食糜中芽孢杆菌的数量(P<0.05)。

表3　不同处理对断奶仔猪生长性能的影响

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。表4同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as Table 4.

表4　不同处理对断奶仔猪养分消化率的影响

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig. 5.

图4不同处理对断奶仔猪回肠微生物的影响(PCR结果)

Fig.4Effects of different treatments on ileum microflora of weaning piglets (PCR results)

图5　不同处理对断奶仔猪盲肠微生物的影响(PCR结果)

3讨论

发酵过程中培养基的质量在很大程度上决定了菌种的生长速度和生物量[5]。甘油是毕赤酵母生长过程中使用最普遍的碳源，甘油的浓度决定了菌体生长的好坏。文献中有报道将葡萄糖作为碳源其性价比优于甘油[6]。而可溶性淀粉因其价格便宜，经过高温可水解成麦芽糖和葡萄糖，故选择可溶性淀粉作为碳源可大大节约生产成本。

由于BSM基础盐培养基成本低，组成简单，能满足毕赤酵母生长所需的养分，且能使毕赤酵母成功分泌外源蛋白，在工业化培养中应用很广[7-9]。毕赤酵母外源基因表达既可在胞内也可分泌到胞外。由于发酵培养基中无外源蛋白，且毕赤酵母自身所分泌的内生蛋白少，故对发酵产物的后续纯化带来便利。

刘斌[10]选择pH、温度和甲醇添加量为自变量因素，通过响应面法，使得重组人源胶原蛋白表达量达到19.49 g/L。Zhao等[11]通过降低25%的BSM盐浓度，将人血清蛋白干扰素表达量提高到215 mg/L。即使是同一表达系统，但对于不同的外源蛋白，其表达量存在很大差异。这可能是由于外源基因自身序列和表达条件的不同所造成。

毕赤酵母的生长和表达主要分为2个阶段。第1阶段为以甘油等碳源为主的生长期，此时期主要以积累菌体为目的，待到碳源耗尽，开始进入第2阶段的诱导表达。第2阶段主要通过流加甲醇作为其分泌表达的碳源。江学斌[12]通过比较间歇流加、恒速流加和指数流加对毕赤酵母生长和表达规律的影响，发现分段控制工艺发酵效果最好，发酵菌体湿重达到415 g/L，这与本试验结果一致。发酵过程中pH的控制是通过补加氨水来实现的。氨水既能调节酸碱平衡，也能为毕赤酵母生长提供氮源。有研究报道，pH在3～7之间，毕赤酵母均能良好生长，且pH恒定在5时，外源蛋白分泌量最高[13]。发酵过程中pH主要影响毕赤酵母中酶的活性、细胞膜通透性以及中间代谢产物的离解。本研究表明，pH在5.5时重组菌丝霉素分泌量最高。毕赤酵母分泌表达产物活性高低与发酵温度也密切相关。温度升高，毕赤酵母代谢速率加快，诱导表达期提前到来，但温度过高又会导致酶失活，菌体出现衰老，发酵周期缩短，影响诱导表达产量。研究报道，毕赤酵母生长最适温度为28 ℃，诱导表达最适温度为30 ℃，诱导期温度过高容易导致酵母细胞死亡[14]。本研究发现，发酵温度在30 ℃，菌体生长良好，诱导表达结果比较理想。本实验室前期摇瓶试验发现，重组菌丝霉素的表达量仅达到143 mg/L，可能原因是摇瓶无法控制温度、pH和溶氧，且无法控制甲醇的流加速度。根据毕赤酵母生长特点，结合分批-补料发酵技术，分别补加生长期碳源(甘油)，诱导表达期碳源(甲醇)和氮源(氨水)，通过溶氧情况来调节补加速度。当溶氧出现迅速上升后开始补加碳源，直至溶氧值控制在20%左右。

本试验菌体在进罐18 h内增长非常缓慢，可能原因是接种量小，菌体密度低。开始流加甲醇时，初期溶氧迅速下降，故需注意流加速度。虽然基础可溶性淀粉组测得蛋白总浓度最高，但通过SDS-PAGE检测发现目的蛋白几乎没有，加之其菌体生长曲线不符合毕赤酵母生长规律，推测发酵过程中由于淀粉类物质不易被酵母细胞所利用，导致大部分酵母细胞发生菌体自容现象，从而导致菌体总蛋白浓度偏高。综合考虑菌体生长曲线，筛选出最适培养基为基础甘油组。

通过SDS-PAGE检测，由图可以看出基础甘油组发酵上清液中杂蛋白少，目的条带清晰，说明诱导表达产物纯度较高。通过酸、碱和胃蛋白酶处理4 h后，重组菌丝霉素抗菌肽对金黄色葡萄球菌依然有强烈抑菌效果，可能是由于重组菌丝霉素分子里含有3个二硫键，使其结构稳定，不易被降解。

目前，饲粮中添加抗菌肽对断奶仔猪生长性能的影响报道较多。抗菌肽由于其抗菌谱广，耐药性低，抗菌作用迅速而备受关注。Yoon等[15]通过比较饲粮中添加阿泊拉霉素和不同剂量抗菌肽A3，结果发现，随着抗菌肽A3添加剂量的增多，能显著提高断奶仔猪ADG，但对ADFI无影响；添加抗菌肽A3后，能显著提高粗蛋白质和干物质的消化率。Xiong等[16]研究发现，在保育料中添加复合抗菌肽可极显著提高ADG和ADFI，极显著降低F/G，对断奶仔猪的生长性能起到了较好的改善作用。Wang等[17]在饲粮中添加乳铁蛋白抗菌肽，结果发现与对照组(无抗生素的基础饲粮)相比，抗菌肽组极显著提高了断奶仔猪的ADG，增幅达到了41.8%，显著降低了F/G。本试验研究结果表明，与CON组相比，AP组显著提高了ADG和ADFI，显著降低了F/G，有提高能量、粗脂肪、干物质等养分消化率的趋势，以及降低断奶仔猪腹泻率的趋势。AP组与CS组相比，差异不显著，说明在生长性能方面，菌丝霉素能起到与抗生素相类似的效果。但是也存在不一致的报道。Shan等[18]和Wu等[19]研究发现，饲粮中添加复合抗菌肽对断奶仔猪ADFI无影响，这可能是由于断奶日龄和体重的不同所造成。菌丝霉素通过与带负电荷的微生物细胞膜结合并插入膜内，导致细胞膜空洞的形成，细胞内容物渗漏，从而杀灭病原菌。大肠杆菌产生内毒素引起炎症反应，导致仔猪腹泻，是一类有害菌。乳酸杆菌是研究报道中较为常见的一类有益菌，在消化道内乳酸杆菌能产生乳酸，消耗氧气，与病原菌抢占肠黏膜结合位点来抑制病原菌的生长繁殖，乳酸杆菌还能抑制细菌细胞膜的生成。芽孢杆菌能产生多种消化代谢的酶，分解饲料中的抗营养因子，提高饲料利用率。双歧杆菌能辅助治疗慢性腹泻和便秘，是一类有益菌[20]。本研究结果表明，添加重组菌丝霉素后能显著提高回肠食糜中双歧杆菌的数量，显著降低盲肠食糜中大肠杆菌的数量。菌丝霉素能杀灭有害菌，减少有害菌对肠道黏膜结合位点的竞争，促进有益菌的生长繁殖，从而维持动物肠道微生物菌群的平衡。由于抗生素对肠道内菌群的杀灭是广谱的，杀灭有害菌的同时也会减少肠道内有益菌的数量，不利于微生物菌群的平衡。由此可见，应用菌丝霉素替代抗生素，可有效维护肠道微生物菌群的平衡。重组菌丝霉素进入体内后，通过抑制肠道内有害微生物的生长，给有益微生物提供了良好的生存空间，更多的有益微生物能促进肠道对营养物质的吸收，从而改善仔猪生长性能，提高养分消化率。

4结论

该研究结果证实了本实验室发酵产品重组菌丝霉素在饲料添加剂行业中具有较大的应用价值及开发前景，在断奶仔猪饲粮中添加重组菌丝霉素能改善断奶仔猪生长性能，提高养分表观消化率，维护肠道微生物菌群的平衡。在今后的研究中还应对发酵条件进一步优化，同时完善该抗菌肽产品的加工工艺，使之更符合动物生理特点。

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(责任编辑陈燕)

Recombinant Plectasin： Screening of Fermentation Medium and Application for Weaning piglets

LI Yan1,2WAN Jin1CHEN Guang2CHEN Daiwen1YU Bing1HE Jun1*

(1.Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Ministry of Education, Animal Nutrition Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China； 2. Chengdu Hualuo Bio-Tech Co., Ltd., Chengdu 610062, China)

Abstract:The study was aimed to investigate the optimization and screening of fermentation medium for the recombinant plectasin, and the effects of recombinant plectasin on growth performance, nutrient digestibility and intestinal microflora in weaning pigs. In the present study, the liquid fermentation was used to prepare the recombinant plectasin in a 30 L fermenter by using batch-fermentation process, and subsequently the expression levels of recombinant plectasin with low salt, basal glycerin and basal soluble starch mediums were compared. Thirty healthy piglets (Duroc× Landrace×Yorkshire) weaned at 24 d were selected and randomly allotted to five groups according to their initial BW. The groups consisted of control group (CON group, a basal diet without antibiotic), sulfuric acid colistin group (CS group, basal diet+0.3% sulfuric acid colistin), antimicrobial peptide group (AP group, basal diet+0.2% recombinant plectasin), probiotics group (PB group, basal diet+0.1% probiotics) and joint application group (PPB group, basal diet+0.2% recombinant plectasin+0.1% probiotics). The experiment lasted for 21 days. The results showed that the wet weight of bacteria in low salt group, basal glycerol group and basal soluble starch group reached the highest value at 114 hours of fermentation, which were 450, 402 and 277 g/L, respectively; the concentrations of total protein in supernatant were 0.38, 3.94 and 5.63 g/L, respectively. Animal trial results showed that compared with CON group, average daily feed intake (ADFI), average daily gain (ADG) and ratio of feed to gain (F/G) were significantly increased (P<0.05) and diarrhea incidence tended to decrease in CS and AP groups (0.05

Key words:recombinant plectasin; antimicrobial peptide; growth performance; nutrient digestibility; weaning piglets

*Corresponding author, professor, E-mail: hejun8067@163.com

中图分类号：S816.7；S828

文献标识码：A

文章编号：1006-267X(2016)01-0208-09

作者简介：李延(1990—)，男，四川成都人，硕士研究生，从事猪的营养研究。E-mail: m18782044216@163.com*通信作者：何军，研究员，博士生导师，E-mail： hejun8067@163.com

基金项目：农业部公益性行业科研专项(201403047)；教育部长江学者和创新团队发展计划(IRT13083)

收稿日期：2015-07-02

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.027