慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

李　健　胡启立　徐　凌　卫　巍　赵　严　刘　华　汤茂春　宋振顺　夏小俊　王兴鹏,5　王　锋△

(1同济大学附属上海市第十人民医院普外科,2消化内科，4急诊科　上海　200072; 3上海交通大学医学院附属

同仁医院消化内科　上海　200336;5上海交通大学附属上海市第一人民医院消化内科　上海　200080)



慢病毒shRNA靶向干扰RegⅣ基因胰腺癌细胞株的构建

李健1胡启立1徐凌2,3卫巍4赵严2刘华2汤茂春2宋振顺1夏小俊2王兴鹏2,5王锋2△

(1同济大学附属上海市第十人民医院普外科,2消化内科，4急诊科上海200072;3上海交通大学医学院附属

同仁医院消化内科上海200336;5上海交通大学附属上海市第一人民医院消化内科上海200080)

【摘要】目的构建并鉴定再生基因4 (regenerating islet-derived family member 4,RegⅣ)短发夹干扰RNA (short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,继而建立稳定干扰RegⅣ基因表达的胰腺癌细胞株PANC-1。方法使用聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)检测RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向干扰RegⅣ基因的shRNA 慢病毒表达质粒pGC-shRNA-RegⅣ,用脂质体转染的方法将载体导入胰腺癌细胞,建立稳定表达shRNA的细胞株。使用荧光定量PCR检测干扰效率。RegⅣ基因过表达载体的构建方法为:将获取的目的基因与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行双酶切,利用电泳回收双酶切产物,转化感受态细胞并进行测序验证,验证成功后,使用Western blot检测其在293T细胞中的表达强度。结果PCR结果显示RegⅣ在PANC-1中表达最高,在BxPC-3中表达最低。测序验证pGC-shRNA-RegⅣ重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胰腺癌细胞株PANC-1后能明显抑制RegⅣ mRNA 表达水平。过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ合成成功后进行Western blot鉴定,验证pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ过表达载体构建成功。过表达RegⅣ基因转染BxPC-3后,与空质粒组相比,RegⅣ表达量明显提高。结论成功建立了靶向稳定干扰RegⅣ基因表达的shRNA胰腺癌细胞株PANC-1。

【关键词】胰腺癌;再生基因4;慢病毒;短发夹干扰RNA

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81472578) and Science and Technology Commission of Shanghai Municipality,China (11JC1410000).

胰腺癌是一种病情进展快、早期诊断困难、早期易转移、恶性程度高的疾病,其发病率几乎等同于死亡率并且呈上升趋势。胰腺癌的平均生存时间小于6个月,5年生存率小于5%,死亡率高居癌症死亡率的第4～5位[1]。如此差的预后归因于其早期易转移的特性。因此,针对胰腺癌侵袭转移的分子机制的研究是一项重要的基础性工作。

Reg家族属钙依赖植物血凝素超家族,该家族属于分泌型蛋白,具有急性期反应、凝集素和抗凋亡及促进生长作用,在G1期增殖和分化中起重要作用,共有4个成员:RegⅠ、RegⅡ、RegⅢ及RegⅣ。近年来在人群、动物模型及细胞家系的研究中发现,RegⅣ在多种胃肠道肿瘤具有特异性表达,某些对肿瘤的转归起到关键作用,如RegⅣ能提高胃癌的腹腔转移率,有助于早期胃癌及腹腔转移的临床诊断,在胃癌细胞中高表达RegⅣ后能显著影响细胞株对5-Fu的敏感性,说明RegⅣ可能抑制某些抑癌药的效果[2-3];大肠癌患者复发后肝转移病例的RegⅣ阳性率明显高于无肝转移的病例,RegⅣ高表达患者的生存率明显低于低表达的患者,提示血清RegⅣ可能会预测CRC肝转移的发生[4-5],RegⅣ还与大肠癌的TNM分期、淋巴结转移相关,并且增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[6]。

在RegⅣ的机制研究中发现,RegⅣ能将胞外信号传递给EGFR和AKT，增加了AP-1转录因子活性,从而导致下游效应的放大,因此RegⅣ可能作为EGFR/Akt/AP-1信号通路的激活剂参与了肿瘤的发生与发展[7]。我们之前的胰腺癌研究中发现RegⅣ是Hedgehog信号通路中转录因子Gli1的靶基因,起到信号传递作用,最终起到影响肿瘤细胞的生物学效应[8]。

RegⅣ是再生基因家族 (regenerating gene family)最新发现的成员,是目前Reg家族中最短小的一个,有6个外显子和5个内含子,编码158个氨基酸的蛋白质,基因定位于染色体1p12～13.1,其17 000的蛋白产物在消化系统的上皮层特异性地表达,在胃肠道细胞的增殖分化过程中发挥重要作用,并同消化系肿瘤的恶性程度、转移和抗药性有关。RegⅣ在胰腺癌的杯状囊泡状结构中或肿瘤细胞胞浆中表达,其在胰腺癌组织以及胰腺上皮内瘤变3期 (PanIN3)标本及胰腺癌患者血清中均呈高表达[9-10]。重组RegⅣ蛋白能呈剂量依赖性促进胰腺癌细胞生长,其促生长效应可能通过PKB/AKT信号通路介导,而RegⅣ的单克隆抗体能抑制胰腺癌细胞的生长[9-10]。RegⅣ在胰腺癌中的高表达与肿瘤的侵袭转移密切相关,高表达RegⅣ的胰腺癌细胞呈现抵抗化疗及放疗的作用,且更易于发生局部复发[11]。我们还证实RegⅣ是Hedgehog信号通路下游靶基因[11]，参与胰腺癌的发生发展。为了更好地研究RegⅣ基因在胰腺癌发病、转移中的作用机制,并为后续的基因治疗提供理论基础,本实验成功设计了针对RegⅣ基因的shRNA序列,构建了过表达载体,并成功构建了低表达RegⅣ基因的胰腺癌细胞株PANC-1。

材 料 和 方 法

材料PCR 引物、双链脱氧核糖核酸Oligo (上海吉凯基因技术有限公司合成),慢病毒载体系统 (上海吉凯基因技术有限公司)包括3种质粒(pGCSIL-GFP载体、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体),其中pGCSIL-GFP载体含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及WRE等辅助元件,同时含有GFP基因,pHelper 1.0和pHelper 2.0含有病毒包装所需的元件。慢病毒的包装细胞293T 细胞株 (中国科学院上海生物所细胞库),胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990 均由上海市第十人民医院消化内科保留。限制性内切酶、T4DNA 连接酶 (英国New England Biolabs公司),DMEM培养基,胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS，美国Gibco公司)、胰蛋白酶 (美国Invitrogen公司),大量质粒提取试剂盒 (德国Qiagen公司),Lipofectamine2000 (美国Invitrogen公司)。

方法

RT-PCR、Western blot法检测各胰腺癌细胞株RegⅣ的表达按照Trizol试剂盒说明提取5种胰腺癌细胞株 (AsPC-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990)总RNA,RT-PCR引物 (上海英骏生物技术有限公司合成)通过Primer 5.0 软件设计。RegⅣ上游引物:5′-CGCTGAGATGAACCCC-AAG-3′,下游引物:5′-TGAGAGGGAAGTGGGA-AGAG-3′,扩增长度145 bp;β-actin上游引物:5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′,下游引物:5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′,扩增长度为145 bp；循环参数制定为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s、进行40个循环后采用2-ΔΔCt进行分析。

常规提取细胞总蛋白,利用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白样品,以12%SDS-PAGE凝胶电泳后,转移至PVDF膜,脱脂牛奶室温封闭2 h,加入一抗 (1∶100)4 ℃孵育过夜,加入二抗 (1∶500)孵育1 h,洗膜后,以化学发光液显像,暗室中进行X光片压片、显影、定影后得到目的蛋白表达变化条带。取重复3次实验后的平均值作为实验结果。

RegⅣ-shRNA慢病毒表达载体的构建RegⅣ (NM_001159352.1)的基因信息来自GenBank,siRNA靶位点的寻找从RegⅣ开放阅读框起始密码子“ATG” 开始,在其下游75至100碱基位置后选取“AA”二连序列后的21个碱基序列。siRNA的设计优先选择GC含量在40%～55%之间的靶基因序列,为了排除同源序列,确定特异性序列,需要将选择的序列与在Gen-Bank中检索获得的基因组数据库信息进行比较。设计4对小干扰RNA序列 (表1)。为了使寡核苷酸形成发夹结构,在每一单链内21nt的寡核苷酸以正反向组合,中间添加loop结构。在shRNA 3′端和5′端分别引入AgeI和EcoR I酶切位点,终止信号TTTTT连接在反义片段后从而终止转录,使后续克隆与鉴定更加方便。取等摩尔量的寡核苷酸干扰片段正负链,将其溶于退火缓冲液中,温度为90 ℃水浴中放置15 min,待其缓慢降至室温,即可获得具有EcoR I和AgeI酶切位点的双链DNA。将上面获得的双链DNA和pGCSIL-GFP载体进行连接,即可获得PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒载体,分别命名为shRNA-RegⅣ-1、shRNA-RegⅣ-2、shRNA-RegⅣ-3、shRNA-RegⅣ-4。将上述4种载体转化到DH5α大肠埃希菌感受态细胞中,摇菌后接种到LB琼脂培养[(含Amp抗性 (100 μg/mL)]上在37 ℃恒温条件下培养16 h,然后将生长的单菌落群进行基因测序以及PCR检测。

RegⅣ基因过表达载体的构建通过PCR的方法从cDNA文库中获取目的基因,上述产物与pEGFP-RegⅣ-3FLAG过表达质粒载体分别进行XhoI、kpnI双酶切,定向交换后通过电泳回收的双酶切产物,然后转化细菌感受态细胞并且进行测序验证,正确后需要Western blot进一步检测该质粒在293T细胞中的表达强度。

慢病毒颗粒的包装和滴度测定首先使用10% FBS的DMEM培养基培养293T细胞,然后选择干扰最明显的shRNA与载体质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0以及重组慢病毒载体PGC-shRNA-RegⅣ共同转染293T细胞,培养8 h和48 h后在荧光显微镜下观察GFP表达,观察是否有明显的绿色荧光,然后收集细胞上清液,其中含慢病毒颗粒。选取96孔板,每孔铺4×104个293T细胞,总体积为100 μL。分别加入90 μL的无血清DMEM培养基于无菌的Ep管中,数量7～10个,其根据为病毒的预期滴度。将待测定的病毒原液10 μL加入到第1个Ep管中混匀,取其中的10 μL加入到第2个Ep管中,以此类推直到最后一管。选择需要的细胞孔,丢弃其90 μL培养基,补充90 μL稀释后的病毒溶液培养24 h,再补充100 μL的完全培养基,在荧光显微镜下观察,计数荧光细胞比例在10%左右的孔中荧光细胞的数量。根据滴度计算公式:荧光细胞数×相应稀释倍数,即可计算出病毒原液的滴度值,单位为 (TU)/mL[9]。

稳定表达PGC-shRNA-RegⅣ人胰腺癌细胞株PANC-1的感染与筛选选取6孔板,将PANC-1细胞分别铺入6孔板中培养,共设3组,分别为:PGC-shRNA-RegⅣ实验组、空白对照组以及空载体组。转染液的配制:50 μL的OPTI-DMEM与2 μL Lipofectamine 2000 混和为A液,50 μL OPTI-DMEM与1 μL PGC-shRNA-RegⅣ混合为B液,将A液与B液混合后即获得转染液。将上述转染液室温放置20 min混匀,加入6孔板中,培养箱中培养6 h,弃去转染液,换无抗生素的含10%FBS的DMEM完全培养基继续培养48 h,在荧光显微镜下观察慢病毒RNAi质粒上GFP的表达 (绿色荧光),观察到至少80%以上的荧光表达。然后即可进行筛选,将6孔板中得培养基换为含杀稻瘟菌素 (1.25μg/mL)的选择性培养基,培养2周后观察是否有含抗体的细胞长出。若有细胞长出,则继续传代培养即可获得稳定表达的细胞株。

荧光定量PCR以及Western blot法共同检测稳定干扰后RegⅣ的表达为检测RegⅣ在各种细胞中的表达情况,选取3种细胞,分别为:PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒稳定转染细胞、转染空质粒的细胞、未转染的细胞。分别提取总RNA,使用紫外分光光度仪进行RNA定量,分别取2 μg RNA并逆转录成cDNA,然后用RT-PCR检测含量 (RT-PCR扩增条件设置:95 ℃ 35 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40个循环)。RegⅣ及内参基因引物同前。结果采用2-ΔΔCt进行分析 (ACt=待测基因Ct值-内参基因Ct值,-AACt=对照组平均Act-样本Act,2-AAc代表基因相对对照组的表达倍数)。重复3次后取其平均值。

结果

RegⅣ在各种胰腺癌细胞中的表达RT-PCR结果显示,RegⅣ在PANC-1中的mRNA水平在5株胰腺癌细胞中表达最高,而BxPC-3表达量最低。在Westernblot实验中也得到同样的数据。选择PANC-1和BxPC-3细胞株进行后续实验 (图1)。

PGC-shRNA-RegⅣ慢病毒载体的PCR电泳及测序鉴定将表达RegⅣ基因的shRNA片段与载体连接后进行PCR电泳,回收电泳中重组阳性克隆,进行测序 (由上海生工完成),其测序结果显示:4组重组的RNA干扰慢病毒载体与设计合成的靶向链是一致的 (图2)。证实shRNA慢病毒干扰载体已成功构建。

DNA were collected from 5 pancreatic cancer cell lines,and relativeRegⅣ mRNA expression were detected by qRT-PCR.All results were normalized to β-actin mRNA.Expression ofRegⅣ proteins in 5 pancreatic cancer cell lines were detected by Western blot analysis on cell extracts,using anti-RegⅣ antibodies.Expression ofRegⅣ is the highest in PANC-1 cell line both in mRNA level and protein level.

图1RegⅣ基因在胰腺癌细胞株中的表达情况

Fig 1The expression ofRegⅣ in

pancreatic cancer cell lines

RegⅣ基因的过表达载体的鉴定成功合成过表达载体pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ后,首先进行Western blot测试,在蛋白水平上进行鉴定 (图3)。图3中泳道1为WB标准品 (48 000),带FLAG标签,以及融合GFP基因;泳道2为空载的293T细胞样品,无表达;泳道3为过表达质粒转染293T后的样品,其中插入的基因片段为477 bp。对3种样品进行Western blot检测,结果显示在45 000处有条特征带。

慢病毒载体包装及其滴度测定将RegⅣ-1干扰序列质粒与慢病毒包装系统质粒同时转染293T细胞 (图4),在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量,将荧光细胞比例在10%左右的孔选择出来,计数荧光细胞个数。病毒原液的滴度值=以上计数×相应的稀释倍数,本实验的测定结果为2.3×108TU/mL,说明病毒已经包装成功,已经有大量质粒成功转入293T细胞。

RegⅣ基因的干扰效率检测使用凝胶图像处理系统对各个慢病毒载体构建的稳定转染胰腺癌细胞株的RegⅣ表达情况进行Western blot分析,结果显示其RegⅣ表达量分别为:共转染空质粒组为95.63%±1.38%;RegⅣ-1干扰序列组为81.77%±1.82%,RegⅣ-2干扰序列组为13.53%±1.76%,RegⅣ-3干扰序列组为60.43%±0.87%,RegⅣ-4干 扰序列组为23.80%±3.06%,RegⅣ-1、RegⅣ-2、RegⅣ-3、RegⅣ-4干扰序列组与空质粒组比差异均有统计学意义 (P<0.05),其中RegⅣ-1干扰效果最明显,在mRNA水平中得到同样的结果。可见RegⅣ-shRNA可明显抑制RegⅣ基因在胰腺癌PANC-1细胞中的表达 (图5)。

The sequence of positive recombinant colons products is the same as that of sequences of primers showed in Tab 1.

图2重组阳性克隆的测序结果

Fig 2The result of sequence analysis of positive recombinant colons products

1:Standard control; 2:293T cell without transfection of pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ;3:293T cell transfection of pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ.

图3重组过表达质粒pEGFP-N1-3FLAG-

RegⅣ Western blot鉴定

Fig 3Recombinant over-expression virus vector pEGFP-

N1-3FLAG-RegⅣ tested by Western blot

A:Phase image×100;B:Fluorescence image× 100.

图4重组慢病毒转染后荧光图

Fig 4Fluorescence microscope image after transfected

with recombinant virus vector

过表达RegⅣ基因的效率检测采用2-△△Ct法分析比较过表达RegⅣ基因转染BxPC-3细胞株后RegⅣ的相对表达。结果显示:在与亲本对照组相比较时,空质粒组RegⅣ mRNA相对表达水平无明显变化,过表达组相对RegⅣ表达量为339.00%±13.26% (图6)。

讨论

RNAi技术包括小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA),小发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA),双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA),微小RNA (microRNAs,miRNA)等。shRNA是具有紧密发夹环的一段RNA序列,发夹结构是由两个短反向重复序列与一个茎环 (loop)序列位组成,茎环结构的作用是分隔两个序列,后附以TTTTT为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。载体中的启动子可以确保shRNA的表达,然后利用载体把shRNA导入细胞,此载体可以与shRNA一起传递到子代细胞中去,使子代细胞的基因也被沉默,从而得以形成稳定持续的转染效果。RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex,RISC)可以结合siRNA,此siRNA来源为被细胞机制切割的shRNA的发卡结构,这些发卡结构可以降解目的基因mRNAs而发挥RNA干扰效应。常用的病毒表达载体包括逆转录病毒、腺病毒和慢病毒等,具有特异、高效的转染效率,RNAi效应高,抑制作用稳定持续。但是逆转录病毒与腺病毒载体系统也都有一定的弊端,如腺病毒载体在实现体内长期稳定表达方面能力不足,并且在多次使用会引起免疫反应[12];而逆转录病毒载体的不足主要表现在当其应用于主要处于静止期的细胞时,其长期表达的特点就难以体现[13],并具有免疫原性和致瘤性问题[14]。本组采用的慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒-1 (HIV-1),是携带干扰RNA的理想载体,其优势在于相对较低的免疫原性和细胞毒性,当其整合到宿主细胞时,可以使得目的基因稳定表达,另外不可忽视的优点在于,其感染效率很高,对于大片段的外源性目的基因包容性较强[15]。

本研究设计的4对干扰靶序列来源是依据PubMed Home所提供的RegⅣ的基因信息,再经过载体连并且随后转化到感受态细胞中后,进行阳性克隆的筛选,测序鉴定结果显示与设计的序列相一致,说明本实验成功构建了4对shRNA-RegⅣ慢病毒载体。本实验随后又将shRNA-RegⅣ慢病毒载体和已经表达目的基因的克隆质粒同时转染293T细胞,并用Western blot进行了蛋白水平的检测,结果发现所构建的载体对目的基因的敲减作用很显著。经过一系列的慢病毒包装以及滴度检测,使得重组慢病毒载体感染细胞的效率较高。当目的基因进入细胞后,经过反转录从而整合到基因组中对RegⅣ产生了持续、高效、特异的抑制,为了使后期研究更具有说服力,我们还成功构建了RegⅣ过表达载体,奠定了后期对RegⅣ在胰腺癌发生发展中的分子机制和动物实验的研究基础。

1:PANC-1 transfected with empty vector control; 2:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ1;3:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ2; 4:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ3; 5:PANC-1 transfected with interference vectorRegⅣ4.

图5RT-PCR及Western blot法检测PANC-1细胞中

RegⅣ基因的表达

Fig 5Expression ofRegⅣ mRNA and proteins were detected

by Western blot and RT-PCR in PANC-1 cell lines

1:BxPC-3; 2:BxPC-3 transfected with empty vector control; 3:BxPC-3 transfected with over-expression vectorRegⅣ.

图6RT-PCR检测RegⅣmRNA在3组细胞中的表达情况

Fig 6Expression ofRegⅣ mRNA in three groups by RT-PCR

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Establishment of pancreatic cancer cells with stable interference by lentivirus shRNA targetingRegⅣ gene

LI Jian1, HU Qi-li1, XU Ling2,3, WEI Wei4, ZHAO Yan2, LIU Hua2, TANG Mao-chun2,SONG Zhen-shun1, XIA Xiao-jun2, WANG Xing-peng2,5, WANG Feng2△

(1DepartmentofGeneralSurgery,2DepartmentofGastroenterology,4DepartmentofEmergency,ShanghaiTenthPeople’sHospital，TongjiUniversity,Shanghai200072,China;3DepartmentofGastroenterology,TongRenHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200336,China;5DepartmentofGastroenterology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200080,China)

【Abstract】ObjectiveTo construct siRNA expression and overexpression vector targeting RegⅣ gene and establish the pancreatic cancer cells PANC-1 with stable inhibition or stable over-expression of RegⅣ gene.MethodsRegⅣ gene expression were examined in several pancreatic cancer cell lines by real-time PCR.The recombinant lentivirus pGC-shRNA-RegⅣ vector and pEGFP-N1-3FLAG-Reg Ⅳ vector were constructed,and then transfected into pancreatic cancer cells by Lipofectamine2000.After pancreatic cancer cells with constant expression of the pGC-shRNA-RegⅣ were established,the interference efficiency of RegⅣ mRNA expression was detected by real-time PCR.ResultsThere was highest expression of RegⅣ gene in the pancreatic cancer cell line PANC-1 and lowest expression in BxPC-3.Recombinant lentivirus pGC-shRNA-RegⅣ vector was successfully constructed by the identification of sequencing.The recombinant vector markedly inhibited RegⅣ gene expression in pancreatic cancer cell line PANC-1.Recombinant lentivirus pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ vector was successfully constructed by sequencing and Western blot, which markedly increased RegⅣ gene expression in pancreatic cancer cell line BxPC-3. ConclusionsRecombinant lentivirus vector pGC-shRNA-RegⅣ and overexpression vector pEGFP-N1-3FLAG-RegⅣ targeting RegⅣ gene was successfully constructed and pancreatic cancer cell line PANC-1 with stable siRNA expression targeting RegⅣ gene and BxPC-3 with stable over-expression were established.

【Key words】pancreatic cancer;regenerating islet-derived family member 4 gene;lentivirus vector;short hairpin RNA

(收稿日期:2015-09-06;编辑:王蔚)

【中图分类号】R576

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.004

国家自然科学基金(81472578);上海市科学技术委员会基金(11JC1410000)

△Corresponding authorE-mail:wolffeng2000@hotmail.com