SLAN-96P型荧光定量PCR仪性能评价及其应用

邱顺华,金李芬

(自贡市第三人民医院，四川自贡 643020)



·临床研究·

SLAN-96P型荧光定量PCR仪性能评价及其应用

邱顺华,金李芬

(自贡市第三人民医院，四川自贡 643020)

摘要:目的评价SLAN-96P型荧光定量PCR仪(SLAN-96P)的主要性能指标及其应用价值。方法按照美国临床实验室标准化协会(CLSI) 文件制定的评价标准，对40份临床血清标本、质控品和标准品进行乙型肝炎病毒DNA (HBV-DNA)定量检测，评价该仪器的准确性、重复性、线性、灵敏度、A模块与B模块的可比性等指标。结果准确度的相对偏倚为0.2%～5.2%；重复性：批内变异系数(CV(批内))为1.37%～2.75%，批间变异系数(CV(批间))为1.52%～2.51%；灵敏度：SLAN-96P能检测的最低HBV-DNA浓度为102 IU/mL；线性：直线回归方程是Y=0.982X+0.094 8，相关系数(r)=0.999；A模块与B模块的可比性：A模块与B模块的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，直线回归方程为Y=1.000 7X+0.012 4，r=0.994。结论SLAN-96P型荧光定量PCR仪各项性能指标良好，SLAN-96P在病原微生物核酸检测方面具有高效、灵敏、快捷、定量的特点，具有很好的临床应用价值。

关键词:SLAN-96P型荧光定量PCR仪；性能评价；乙型肝炎病毒DNA

PCR技术作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传学与分子生物学的发展，而且在其他生命科学领域也得到广泛应用。荧光定量PCR技术是应用最为广泛的技术，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便的优点，在临床病毒诊断中具有巨大的应用价值。乙型肝炎病毒DNA (HBV-DNA)的检测有助于诊断病毒的感染情况，动态监测肝炎病毒的复制情况，动态观察用药后抗病毒的效果。特别是那些慢性乙型肝炎患者乙型肝炎e抗原(HBeAg)阴性，但仍然伴有高水平的HBV复制，检测HBV-DNA可以判定病毒复制情况[1-2]。临床治疗过程中，患者血清中HBV-DNA载量下降2个Log值，说明治疗有效，而患者用药3个月后病毒载量没有下降，表示治疗无效[3-4]。因此，测定结果的准确对临床诊断、治疗及疗效观察尤为重要。荧光定量PCR仪是美国ABI公司于1996年首次开发出来。目前我国也开发出许多品牌的荧光定量PCR仪，SLAN-96P型荧光定量PCR仪是由上海宏石有限公司开发出来。为了验证其PCR检测结果准确性，笔者对自贡市第三人民医院引进的SLAN-96P型荧光定量PCR仪进行主要性能指标的评价试验，分析仪器的性能特性，现报道如下。

1材料与方法

1.1一般资料临床标本来源于自贡市第三人民医院门诊和住院患者，收集40例符合要求且经本院SLAN-96P荧光定量PCR仪检测HBV-DNA的不溶血、不脂血患者血清标本，分装于1.5 mL离心管内，置于-20 ℃保存备用。

1.2仪器与试剂主要仪器：SLAN-96P型实时荧光定量PCR仪(上海宏石有限公司)、生物安全柜、离心机等。试剂：HBV-DNA定量检测试剂盒及HBV-DNA标准品均由湖南圣湘生物科技有限公司提供。质控品血清：由卫生部临检中心提供的HBV-DNA质控品。

1.3方法

1.3.1准确度验证试验以卫生部室间评价结果靶值为真值，靶值±0.4Log为允许范围，计算测定结果与真值之间的偏倚。偏倚=(测定值-真值)/真值×100%。

1.3.2重复性试验按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)评价标准，在SLAN-96P荧光定量PCR仪器上检测106、105、104IU/mL 3个浓度的HBV-DNA。批内重复性试验在相同条件下对同一标本在一天内测定20次；批间重复性试验每天各测定1次，连续测定20 d，分别计算出批内和批间的平均值、标准差和变异系数。

1.3.3灵敏度试验用质控血清稀释至103、102、10 IU/mL 3个水平浓度，在SLAN-P6P荧光定量PCR仪重复测定10次，根据其阳性检出率判断其灵敏度。

1.3.4线性测定分别取4×107、4×106、4×105、4×104IU/mL的标准品，在SLAN-P6P荧光定量PCR仪测定1次，将检测值和预测值做直线相关分析。

1.3.5A模块与B模块比对试验选取40份HBV-DNA阳性的临床血清标本，浓度为103～108IU/mL。在SLAN-P6P荧光定量PCR仪的A模块和B模块平行测定HBV-DNA，每天检测8个标本，连续检测5 d，计算A模块与B模块结果的相关性。

1.4统计学处理所有统计数据都经对数转换后采用EXCEL2003进行统计分析。SPSS17.0统计软件进行直线相关分析及配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1SLAN-96P 准确度通过表1可知，1411、1412、1414标本为阳性，测定结果的偏倚分别为5.2%、0.2%、3.2%，3个阳性标本准确度评价良好，均符合卫生部要求。1413和1415为阴性，测定结果也为阴性。

表1 HBV-DNA卫生部评价标本测定结果及偏倚

2.2重复性结果批内变异系数(CV批内)为1.37%～2.75%，批间变异系数(CV批间)为1.52%～2.51%，3种浓度的HBV-DNA在SLAN-96P荧光定量PCR仪上检测的CV批内和CV批间均符合卫生部标准，见表2。

表2　　SLAN-96P 重复性试验结果

2.3灵敏度分析103IU/mL浓度的HBV-DNA病毒血清在SLAN-96P荧光定量PCR仪上扩增分析，具有明显的扩增曲线，检出率为100%；102IU/mL浓度的血清检出率降至100%;10 IU/mL浓度血清检测时无明显的扩增曲线，检出率仅为30%。因此，SLAN-96P荧光PCR仪能检测的最低HBV-DNA浓度水平为102IU/mL。

2.4线性测定结果将4个浓度梯度的HBV-DNA标准品在SLAN-96P上检测分析得到：直线回归方程Y=0.982X+0.094 8，相关系数(r)=0.999。

2.5A模块与B模块比对试验结果A模块与B模块的两组检测结果进行配对t检验，P=0.515，提示A模块与B模块的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)；A模块与B模块的直线回归方程及相关系数：Y=1.000 7X+0.012 4，r=0.994。

3讨论

目前，荧光定量PCR技术广泛应用于临床，可以检测多种病原微生物。荧光定量PCR技术融汇了PCR 技术的核酸高效扩增，光谱技术的高敏感性，探针技术的高特异性和高精确定量的优点，直接监测PCR过程中荧光信号的变化以获得准确的结果，可以弥补定性PCR的不足[5]。SLAN-96P型荧光定量PCR仪使用LED灯作为光源，实现永久的光源寿命[6-8]；采用了半导体导热系统，每个反应孔均有独立的温控监测点和高效的散热系统，确保均一的反应孔温度，无边缘效应[9-10]；设立了两个独立的反应模块A/B，一台荧光PCR仪可以作为两台普通的荧光PCR仪来用。

HBV-DNA定量检测可以定量反映乙肝患者体内病毒复制情况，是检测乙肝病毒的最可靠方法，对临床抗病毒治疗的疗效观察及指导临床用药具有重要价值。目前，荧光定量PCR技术检测HBV-DNA是HBV检测的“金标准”，已广泛应用于临床，为急、慢性乙型肝炎患者的诊治、疗效的观察及预后的判定提供了可靠依据[11-13]。

SLAN-96P准确度试验表明：5个卫生部质控标本均符合卫生部要求，其中1411、1412、1414这3个阳性标本测定结果的偏差分别为5.2%、0.2%、3.2%，均小于ISO15189要求的7.5%。重复性试验结果表明：104、105、106IU/mL 3个数量级水平浓度的CV批内和CV批间值均小于5%，具有良好的重复性。灵敏度试验表明：SLAN-96P在HBV-DNA浓度为103和102IU/mL时检出率均高达100%，具有较高的灵敏度，提示在一定程度上可以降低假阴性率，提高检出率；10 IU/mL时检出率较低，可能原因是吸样随机误差造成的检出率低。线性试验表明：4个梯度浓度的标准品，检测得到的r为0.999，大于厂家要求的0.98，为HBV-DNA定量提供参照标准，保证定量结果准确。SLAN-96P仪器的A模块与B模块比对试验表明：A模块与B模块的检测结果r为0.994，相关性很好；配对t检验结果为P=0.515>0.05，提示SLAN-96P仪器的A模块与B模块的检测结果差异无统计学意义，均能检测临床标本[9-13]。

综上所述，SLAN-96P型荧光定量PCR仪的准确度、重复性及灵敏度均达到卫生部的要求，线性范围较宽，为临床病原微生物的检测提供一个良好的检测系统，可满足临床检测的需要。

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(收稿日期：2015-12-16)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.036

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0801-03