显微镜观察药物敏感性技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的研究*1

付佑辉，张　舒，王海涛，蔡　峰，范艳红，胡忠义

(1.上海市第七人民医院呼吸内科，上海 200137；2.同济大学附属上海市

肺科医院，上海市结核病[肺]重点实验室，上海 200433)



·论著·

显微镜观察药物敏感性技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌的研究*1

付佑辉1，张舒1，王海涛1，蔡峰1，范艳红1，胡忠义2

(1.上海市第七人民医院呼吸内科，上海 200137；2.同济大学附属上海市

肺科医院，上海市结核病[肺]重点实验室，上海 200433)

摘要:目的探讨显微镜观察药物敏感性技术(MODS)在痰液标本中结核分枝杆菌(MTB)的检测效果，以评价其临床应用价值。方法收集150份患者临床痰标本，应用MODS技术、罗氏培养法进行MTB的检测，将两法的结果进行对比分析。结果MODS技术与罗氏培养法结果符合率为77.8%，MODS技术检测痰标本中MTB的敏感性为93.3%，特异性为70.0%，阳性预测值(PPV)为60.8%，阴性预测值(NPV)为95.4%，正确性为77.8% 。结论MODS技术检测痰标本中MTB具有快速、灵敏、简便等优点，可作为结核病细菌学快速检测的新方法之一。

关键词:痰液；结核分枝杆菌；显微镜观察药物敏感性技术

结核病仍然是严重威胁人类健康的重大传染病之一[1]。目前结核病实验室检测技术仍不能满足临床需要，因此开展结核病实验室诊断新技术对结核病诊治具有重要意义。近年来Caviedes等建立了一种结核病快速诊断新技术——显微镜观察药物敏感度检测技术(MODS)，据报道它具有简便、快速、灵敏、价廉的优点[2-4]。笔者在MODS技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)临床分离株方法学的基础上，进一步将其应用于患者痰液标本的结核分枝杆菌(MTB)的直接检测，并与传统的痰涂片抗酸染色法、罗氏培养法的结果进行分析比较，对结果不符的标本，采用Gene-Probe方法进行鉴定，以评价其检测效果及价值。

1材料与方法

1.1材料90例临床诊断肺结核患者痰液标本取自上海市第七人民医院呼吸内科住院患者及结核科门诊患者。60例非肺结核的肺部疾病患者痰液标本取自本院呼吸科住院患者，包括肺炎、肺癌、慢性支气管炎、支气管扩张等疾病的患者。MTB标准菌株(H37Rv)购自国家菌种保藏中心。

1.2仪器与试剂XDS-1B倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司 )，瑞士24孔TPP细胞培养板。硝基苯甲酸(Sigma公司)储存液的制备：取硝基苯甲酸纯药粉溶于0.1 mol/L 氢氧化钠(NaOH)中，再取0.1 mol/L 氯化氢(HCl)溶液调pH值至6.5，加无菌蒸馏水制成5 mg/mL储存液，然后将上述配制好的储存液用无菌滤膜过滤、分装，-20 ℃保存。应用时取出，常温下溶解，倍比稀释，配置成浓度为1 600 μg/mL的工作液。液体培养基Middlebrook 7H9培养基干粉(美国Difico公司)和营养添加剂OADC(Becton Dickinson公司)。应用液为含10%营养添加剂的Middlebrook 7H9液体培养基。罗氏培养基，鉴定培养基按《结核病诊断细菌学检查规程》(规程)制备[5]。

1.3方法

1.3.1MODS技术检测痰液标本中MTB将150份患者痰液标本液化去污染处理引后的沉淀，用液体培养基洗涤2遍，用6 mL液体培养基重悬。运用MODS技术进行检测并同步将其接种至罗氏培养基进行培养和鉴定,每块24孔细胞培养板做11份痰液标本，自孵育后第3 天开始用倒置显微镜进行观察(×10目镜与×40物镜)，每天观察1次，第15天后每周观察2次，至40 d结束，具体操作方法见文献[9]，每批标本检测以MTB标准菌株H37Rv为质控株。

1.3.2罗氏培养和鉴定法药物浓度分别为对硝基苯甲酸0.5 μg/mL、噻吩-2-羧酸肼5 μg/mL，参照文献[5]方法操作。

1.3.3痰涂片抗酸染色法参照文献[5]方法操作。

1.3.4Gene-Probe检测Gene-Probe诊断试剂和检测仪为美国Gene-Probe公司产品，购自生物梅里埃公司。按照仪器使用说明和试剂盒要求进行操作[6-7]。

1.4统计学处理计算其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和符合率。对患者痰液标本中MTB应用MODS技术检测的结果与罗氏培养法测定的结果进行比较分析，采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1MODS技术与罗氏培养法所需时间比较应用MODS技术对150份患者痰液标本中MTB进行检测，阳性检出时间自5～28 d不等，检测时间中位数为11 d，而罗氏培养法检测时间中位数为20 d，MODS技术检测时间中位数短于罗氏培养法。

2.2痰液标本三种检测方法检测结果比较90份临床确诊为肺结核患者的痰液标本涂片抗酸染色法、罗氏培养法及MODS检测的阳性结果分别为24份(26.7%)、30份(33.3%)和46份(51.1%)；60份非结核的肺部疾病患者痰液标本3种方法检测的假阳性结果分别为2份(3.3%)、2份(3.3%)和1份(1.7%)；比较3种检测方法的阳性率，差异有统计学意义(χ2=12.42,P<0.05)。比较3种方法的假阳性率，差异无统计学意义(χ2=0.54，P>0.5)，见表1、2。90份临床确诊为肺结核患者痰液标本的检测结果表明，MODS技术与传统罗氏培养法结果符合率为77.8%，如以罗氏培养、鉴定法为判断标准，则MODS技术检测MTB的敏感性为93.3%(28/30)、特异性为70%(42/60)、阳性预测值(PPV)为60.8%(28/46)、阴性预测值(NPV)为95.5%(42/44)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1　　MODS技术和罗氏培养法结果比较(n)

表2　　MODS技术和涂片抗酸染色法结果比较(n)

2.3Gene-Probe检测结果在60例临床诊断为非肺结核患者痰液标本中，有1份痰涂片抗酸染色和罗氏培养均为阴性而MODS技术检测为阳性，临床分离菌株经Gene-Probe鉴定为堪萨斯分枝杆菌。在临床诊断为肺结核的90例患者痰液标本中，有2份罗氏培养法阳性而MODS技术检测结果为阴性，其临床分离菌株Gene-Probe经鉴定，1株为MTB,1株为鸟分枝杆菌，罗氏培养法与MODS技术检测结果不符有20例,痰涂片抗酸染色法与MODS技术检测结果不符有24份。罗氏培养法为阴性而MODS技术检测为阳性的痰液标本有18份，Gene-Probe检测结果为阳性的痰液标本有16份(88.9%)，痰涂片抗酸染色法检测结果为阴性而MODS技术检测结果为阳性的痰液标本有24份，Gene-Probe检测结果为阳性的痰液标本有22份(95.7%)。18份痰涂片抗酸染色法和罗氏培养法结果均为阴性而MODS技术检测结果为阳性的痰液标本中，Gene-Probe检测结果为阳性的痰液标本有17份(96%)；另外有1份临床诊断为非肺结核患者痰液标本，痰涂片抗酸染色法和罗氏培养法结果均为阴性而MODS技术检测结果为阳性，经Gene-Probe检测结果为阳性。

3讨论

目前MTB细菌学检测技术由于存在一定缺陷，如价格昂贵、敏感性差、需时较长等，因此远不能满足临床诊治的需求。2000年Caviedes等建立了一种新的结核病细菌学检测技术——显微镜观察药物敏感度检测技术，其原理为： MTB在液体培养基中生长时会呈现特征性的索状结构，应用倒置显微镜对其特征性索状结构进行观测，可用来判断是否有MTB生长，据研究表明该技术具有快速、简便、价廉等特点。随后，有学者将其用于结核病的快速诊断，显示出良好的应用前景[6-8]。

笔者在前期建立了MODS技术快速检测MTB临床分离株检测方法学的基础上，进一步将其应用于痰液标本中MTB的直接检测，并与痰涂片抗酸染色法、罗氏培养法结果进行对比分析后，可以得出MODS技术的阳性检出率显著高于涂片和罗氏培养，如以罗氏培养、鉴定法为判断标准，MODS技术具有较高的灵敏度。本研究中痰液标本的阳性检出率、检测时间中位数、特异度与相关文献报道的数据相比偏低，可能与选用的痰液标本多数来自治疗患者有关，其服药后痰菌中有大量死菌存在，细菌活力较低[2,3,8-10]。在应用MODS技术直接检测痰液标本时，因检测所需时间比检测临床分离株所需的时间长，检测过程中应采取适当措施，如本研究中用胶带密封24孔细胞培养板，并放置密封的塑料袋内等以防止检测板孔中水分蒸发。

本研究对MODS技术检测的结果与罗氏培养法检查结果不符的痰液标本采用Gene-Probe检测分析，如以Gene-Probe结果作为判定依据，合计Gene-Probe检测47份MODS技术与涂片抗酸染色法或罗氏培养法检测结果不符的痰液标本，结果40份(85.1%)的MODS技术检测结果与Gene-Probe结果相同，说明MODS技术检测结果具有较高的准确性。笔者早期研究发现临床常见的2种非MTB——耻垢分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌也具有索状生长特征[11-13]，因此，笔者在MODS技术检测MTB中进行了优化改良，在应用MODS技术检测时加入对硝基苯甲酸作为菌种鉴定试剂，使MODS技术对MTB的检测更加特异。本研究有1份非结核患者痰液标本涂片和培养均为阴性而MODS技术为阳性，菌株经Gene-Probe鉴定为堪萨斯分枝杆菌，进一步得到了证实。

综上所述，将MODS技术用于痰液标本中MTB的检测，具有快速、准确的优点，同时该技术在检测过程中无需昂贵仪器设备，只需孵箱以及显微镜就能进行检测，因此操作简便、检测成本低廉[11-13]，可以满足临床对MTB快速检测的需求，由于MODS技术检测的是活菌，因此可为肺结核活动性诊断提供较有力证据，其价廉的优势也易被大多数基层结核病检测机构所接受，具有良好应用前景。但是值得注意的是MODS技术检测是活菌，操作中一定要注意生物安全，操作过程中以下几方面需注意：(1)进行实验操作时，采取相应的防护措施(如需穿戴好口罩、帽子、隔离服、手套等)；(2)实验操作需在生物安全柜中进行；(3)应用倒置显微镜观察结果时，24孔细胞培养板需密封后才能进行观察，观察时需小心谨慎，避免打翻；(4)实验结束后，24孔细胞培养板及废弃物必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。

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Evaluation microscopic observation drug susceptibility assay in detecting mycobacterium tuberculosis in sputum*1

FuYouhui1，ZhangShu1,WangHaitao1,CaiFeng1,FanYanhong1，HuZhongyi2

(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,theSeventhPeople′sHospitalofShanghai,Shanghai200137,China;2.TBKeyLaboratoryofShanghai,ShanghaiPulmonaryDiseaseHospitalAffiliatedtoTongjiUniversity,Shanghai200433,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of microscopic observation drug susceptibility assay(MODS)for testing Mycobacterium tuberculosis in sputum,and to evaluate its clinical value.MethodsA total of 150 sputum samples were collected from patients with pulmonary tuberculosis,and Mycobacterium tuberculosis were detected by Lowenstein-Jensen (L-J) method and MODS,and compared the results of the two methods.ResultsThe concordance rates of the test results of sputum sample between MODS and L-J was 77.8%.The sensitivity and specificity of MODS were 93.3% and 70.0%,positive predictive value (PPV) was 60.8%,negative predictive value (NPV) was 95.4%，as well as accuracy by MODS was 77.8%.ConclusionMODS assay could be used as a rapid tuberculosis detection method,with rapid,sensitive,simple,and other advantages.

Key words:sputum;Mycobacterium tuberculosis;microscopic observation drug susceptibility assay

(收稿日期：2015-12-11)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.004

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0728-03

基金项目：上海市浦东新区卫生和计划生育委员会卫生科技项目(PW2012B-4)。

作者简介：付佑辉，男，主治医师，主要从事呼吸系统疾病诊断研究。