2种方法检测热毒宁与头孢哌酮钠/舒巴坦钠对广泛耐药鲍曼不动杆菌协同作用的比较*1

李　新，杨桂芳，陈化禹，耿　洁，贾志杰

(天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)



·论著·

2种方法检测热毒宁与头孢哌酮钠/舒巴坦钠对广泛耐药鲍曼不动杆菌协同作用的比较*1

李新，杨桂芳，陈化禹，耿洁，贾志杰

(天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)

摘要:目的观察微量肉汤棋盘稀释法与纸片扩散法检测体外环境下中药热毒宁联合头孢哌酮钠/舒巴坦钠(SCF)对广泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR-AB)协同作用的结果，比较两者的符合性，以指导临床用药。方法筛选2015年该院住院患者感染的XDR-AB共12 株，将菌株培养传代，先采用微量肉汤棋盘稀释法检测SCF和热毒宁单独及联合使用时的最低抑菌浓度(MIC),通过计算判断是否有协同作用,再使用纸片扩散法检测抑菌环直径和药物的协同作用。结果微量肉汤棋盘稀释法检测热毒宁与SCF联合用药时，与单独用药时相比，MIC均有不同程度下降，热毒宁与SCF联合用药时的抑菌浓度指数均小于或等于0.5,具有协同作用。纸片扩散法测定出热毒宁原液的抑菌环直径为10 mm，不同XDR-AB菌株对SCF的抑菌环直径有所差异，其中5株为15 mm，3株为16 mm，4株为17 mm。但当热毒宁与SCF联合作用时，抑菌环直径扩大，12株也都出现了协同作用。结论体外环境下，热毒宁联合SCF对XDR-AB有很好的协同作用,2种方法结果一致，虽然纸片法更加简便,但结果判断带有一定主观性,需要有经验的人员操作。

关键词:广泛耐药鲍曼不动杆菌；热毒宁；头孢哌酮钠/舒巴坦钠；微量肉汤棋盘稀释法；纸片扩散法

鲍曼不动杆菌已经成为我国院内感染最重要的病原菌之一[1]，常引起呼吸道感染、泌尿系统感染、败血症、继发性脑膜炎等。近年来，随着广谱抗菌药物在临床的广泛应用，鲍曼不动杆菌的耐药性不断增加，出现了广泛耐药鲍曼不动杆菌(XDR-AB)，其对常用抗菌药物几乎全部耐药，仅对多黏菌素和替加环素敏感[2]，给临床治疗带来了很大挑战，开发新的治疗方案和新型药物迫在眉睫。本研究观察了热毒宁与头孢哌酮钠/舒巴坦钠(SCF)联合使用对XDR-AB的体外抑菌作用，并对两种方法进行了比较,旨在更好地为临床治疗提供依据。

1材料与方法

1.1材料12株XDR-AB分离自2015年1～6月本院住院患者，其中10株来源于痰液标本，2株来源于尿液标本。根据《全国临床检验操作规程(第3版)》选用法国梅里埃公司Vitek-2 Compact全自动微生物分析系统及配套的分析卡进行菌种鉴定和药敏试验。药敏结果按2012 年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准判断。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。SCF由美国辉瑞公司提供，商品名为舒普深注射针剂，热毒宁注射液由江苏康缘药业提供，药敏纸片为辉瑞公司提供的SCF(75/30 μg)纸片。

1.2方法

1.2.1SCF对XDR-AB的最小抑菌浓度(MIC)将XDR-AB菌株培养传代，分离单个菌落，用比浊仪配制细菌悬液1×108CFU/mL，再用水解酪蛋白(M-H)肉汤以1∶100稀释(含菌量约106)备用。用M-H肉汤将SCF原液倍比稀释成浓度为256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL的药液，分别取各浓度药液50 μL，依次由低浓度到高浓度加到96孔板中并做好标记。取备用菌液50 μL分别加入已加药的孔中，使最终接种菌量约5×105CFU每孔。另设无菌对照孔(孔内只加M-H肉汤100 μL)和无药对照孔(孔内只加M-H肉汤和菌液各50 μL)，振荡1 min混匀后，35 ℃恒温培养箱孵育20 h，肉眼观察结果，记录MIC[3]。

1.2.2热毒宁对XDR-AB的MIC配备终浓度为原液的1.00、0.80、0.64、0.51、0.41、0.33、0.26、0.21、0.17倍的热毒宁，分别取各浓度药液50 μL，依次由低浓度到高浓度加到96孔板中并做好标记。分别取备用菌液50 μL加入已加药的孔中。另设无菌对照孔(孔内只加M-H肉汤100 μL)和无药对照孔(孔内只加M-H肉汤和菌液各50 μL)，振荡1 min混匀后，35 ℃恒温培养箱孵育20 h，肉眼观察结果，记录MIC。

1.2.3微量肉汤棋盘稀释法测定热毒宁联合SCF对XDR-AB的抑菌作用称量并配制2倍MIC的药物，将SCF倍比稀释成8个浓度，方法同1.2.1,热毒宁配制浓度方法同1.2.2。在96孔板上做好标记，SCF从上到下依次递减，热毒宁从左到右浓度依次递减，另设无菌对照孔和无药对照孔。在96孔板中，每个对应孔加两种药液各50 μL和菌液100 μL后，振荡1 min混匀，35 ℃孵育20 h，观察抑菌浓度指数(FICI)。

1.2.4纸片扩散法检测热毒宁及SCF单独的抑菌环直径将经培养基传代后的细菌配制成相当于0.5麦氏比浊管浓度的菌悬液，用无菌棉签取配制好的细菌悬液均匀涂布于M-H琼脂培养基表面，放置10 min待平板表面菌液吸收，用直径7 mm的无菌打孔器在每个涂菌的固体培养基上垂直均匀打2个孔，分别加入热毒宁原液和注射用水各200 μL。在距热毒宁孔2 cm以外贴SCF纸片，35 ℃培养20 h。用游标卡尺测量每个抑菌环的直径，抑菌环边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限[3]。中药抑菌圈直径：<8 mm为不敏感(-)，8～<13 mm为低度敏感(+)，13～<19 mm为中度敏感(++)，≥19 mm为高度敏感(+++)。SCF抑菌环直径：≤15 mm为耐药，16～20 mm为中介，≥21 mm为敏感。

1.2.5纸片扩散法测定联合抑菌作用同样的方法检测SCF和热毒宁的联合作用。检测两者协同作用时，最好控制在大于两药抑菌环半径之和2 mm结果较理想,以两种药物之间的敏感区域增加为有协同现象。

1.3统计学处理采用Excel2007软件进行数据处理及统计学分析。

2结果

2.1热毒宁与SCF单独用药时MIC及两者联合时FICI热毒宁与SCF联合用药时的FICI均小于或等于0.5，说明两者有协同作用。见表1。

表1　　热毒宁与SCF单独用药时MIC及两者联合用药时FICI

2.2热毒宁与SCF的协同作用经纸片扩散法测定出热毒宁原液的抑菌环直径为10 mm，不同XDR-AB菌株对SCF的抑菌环直径有所差异，其中5株为15 mm，3株为16 mm，4株为17 mm。当热毒宁与SCF联合使用时，出现了协同作用。见图1。

箭头1：阴性对照；箭头2～3：热毒宁与SCF的协同作用。

图1热毒宁与SCF的协同作用

3讨论

鲍曼不动杆菌耐药现象十分严重，对氨基糖苷类、氟喹诺酮类及β-内酰胺类等抗菌药物均产生了一定的耐药性，具有多重耐药基因[4]，给临床治疗造成了极大困难。本研究用微量肉汤棋盘稀释法及纸片扩散法探讨了中药热毒宁与SCF对XDR-AB的联合作用。本研究观察到热毒宁对XDR-AB抑菌环为10 mm,有轻度抑菌作用，如果临床单独用热毒宁治疗XDR-AB感染可能不易取得满意结果。联合热毒宁后，菌株对SCF的敏感性明显提高。夏美玲等[5]将黄芩、金银花与阿奇霉素联用，对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比单用阿奇霉素明显增强。马东梅等[6]发现双黄连对XDR-AB有抑制作用，其认为中药联合抗菌药物应用可降低抗菌药物使用量。SCF对XDR-AB的MIC明显下降，下降浓度最高可达1/64 MIC。不同XDR-AB菌株对SCF的抑菌环直径有所差异，其中5株为15 mm，3株为16 mm，4株为17 mm，这3组XDR-AB的MIC分别为128、64、32 μg/mL。不同菌株对SCF的敏感性不同。与热毒宁联合使用后，MIC为128 μg/mL的一组，SCF和热毒宁的MIC下降幅度最大。可见中药热毒宁与SCF对XDR-AB有很好的协同作用。

纸片扩散法是根据抑菌环直径和抗菌药物MIC的负相关性质设定的定性试验，由于该方法简便可靠，实用性强，仍是目前常规实验室普遍采用的定性试验，本研究在判断产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的纸片协同法的基础上[3]，参照管仲莹等[7]的金银花抑菌作用研究，尝试用SCF纸片扩散联合热毒宁打孔的方法观察协同作用。SCF选用浓度为75/30 μg SCF作为药敏纸片，热毒宁使用原液。双纸片协同试验影响因素较多,掌握好两药之间的距离很关键,经过多次摸索，最好控制在大于两药抑菌环半径之和2 mm，与微量肉汤棋盘稀释MIC法比对，结果一致。但在操作过程中应注意设置对照,选择最佳的纸片间距。

微量肉汤棋盘稀释法联用两种药物，以二维棋盘纵横两个方向分别进行倍比稀释。药物相互作用效应通过计算最小部分FICI来判断。FICI=(联合用药时SCF的MIC/单独用药时SCF的MIC)+(联合用药时热毒宁的MIC/单用时热毒宁的MIC)。FICI≤0.5为协同作用，0.52.0为拮抗作用[8]。在采用MIC微量肉汤棋盘稀释法检测热毒宁联合SCF作用XDR-AB时，以无菌对照孔作为敏感的标准，以无药对照孔作为耐药的标准，分别记下两药单独和联合的MIC，再计算FICI。但由于热毒宁本身为棕褐色，敏感和耐药结果不是特别清晰，且操作繁琐，需要稀释不同浓度的SCF和热毒宁。热毒宁与SCF联合用药时的FICI均小于或等于0.5，说明两者有协同作用，与纸片扩散法得到的结果一致。

综上所述，微量肉汤棋盘稀释法可以检测到MIC，可以量化观察两种药物对XDR-AB的联合作用，但很繁琐。而纸片扩散法简单易行，也可以直观地反映出两种药物的联合作用，结果判断带有主观性,需要有经验的人员操作。随着广泛耐药菌的出现，中西医结合治疗也是很好的治疗方案，笔者下一步将深入到分子生物学继续研究中西药联合应用的抗菌机制。

参考文献

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[3]徐英春,金岩,王澎,等.三种方法检测超广谱β内酰胺酶敏感性比较[J].中华医学检验杂志，1999，22(6)：355-357.

[4]周玉，丛玉隆，曲芬.鲍曼不动杆菌耐药机制及治疗策略研究进展[J].传染病信息，2014，27(3)：184-188.

[5]夏美玲，冯海英，刘野.中西药联合体外抑菌试验的研究[J].医学研究杂志,2010,39(10):100-102.

[6]马冬梅，陶庆春，齐宏伟，等.中药双黄连对广泛耐药鲍曼不动杆菌的体外抑菌实验研究[J].实用临床医药杂志，2014，18(16)：109-111.

[7]管仲莹,赵金明,林巧智.金银花提取物抑菌作用的实验研究[J].中医中药,2009,47(15):150-153.

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Comparison of two methods testing synergistic action of Reduning and cefoperazone sodium/sulbactam sodium on extensive drug resistant Acinetobacter bauman*1

LiXin,YangGuifang,ChenHuayu,GengJie,JiaZhijie

(TheFirstAffiliatedHospitalofChineseTraditionalMedicalUniversityofTianjin,Tianjin300193,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the results of broth dilution method and disc diffusion method to test the synergistic effect of Reduning and cefoperazone sodium / sulbactam sodium(SCF) on extensive drug resistant Acinetobacter bauman (XDR-AB) in vitro environment,and compare their compliance to guide the clinical medication.MethodsA total of 12 strains of XDR-AB from infection patients in our hospital in 2015 were collected,the strain was sub cultured.Firstly,observe the minimum inhibitory concentration (MIC) of SCF and Reduning on XDR-AB alone and in combination by broth dilution method.And then judge the synergy effects through calculation.Secondly,the inhibition ring diameter and the synergy effects was detected using the disc diffusion method.ResultsThe MIC of Reduning and SCF in combination on XDR-AB was declined compared with them alone.The Fractional inhibitory concentration of Reduning and SCF in combination on XDR-AB were equal or less than 0.5,they had synergistic effect on XDR-AB.The inhibition ring diameter of Reduning was 10 mm tested by disk diffusion method.Different strains of XDR-AB on SCF bacteriostatic annulus diameter difference,5 strains were 15 mm,3 strains were 16 mm,and 4 strains were 17 mm.Reduning and SCF appeared synergistic effect according to the inhibition ring diameter expanded when they effected on XDR-AB in combination.ConclusionIn vitro,Reduning combined with SCF on XDR-AB has good synergistic effect.Compared with broth microdilution checkerboard dilution method,disk diffusion method is more simple and convenient,but it has a certain subjective on judging results,which is better to operate by experienced person.

Key words:extensive drug resistant Acinetobacter bauman;Reduning;cefoperazone sodium/sulbactam sodium;broth microdilution checkerboard dilution method;disc diffusion method

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.002

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0723-03

基金项目：天津市中医药管理局中医中西医结合科研课题项目(13065)。

作者简介：李新，女，副主任技师，主要从事临床微生物研究。