白芨愈伤组织诱导研究

付颖聪，李小清，王红雷，赵永清

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)

白芨愈伤组织诱导研究

付颖聪，李小清，王红雷，赵永清*

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)

目的：以白芨假鳞茎为培养材料，进行愈伤组织诱导和抗褐化研究.方法：使用兰科常用培养基MS,B5，KC分别作为基础培养基，应用正交试验方法设计生长调节剂配比.结果：当基础培养基为MS培养基时，并且6-BA 1.5 mg/L + 2，4-D 3.0 mg/L时,愈伤组织诱导率最高，达73.3%.另外，添加活性炭可防止外植体褐化：活性炭含量为1.5 g/L时，褐化率为44%，愈伤组织诱导效果最好；活性炭含量为3.0 g/L时，褐化率最低为11%，愈伤组织诱导效果不好.结论：白芨愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+2, 4-D 3.0 mg/L+AC 2 g/L.

白芨假鳞茎；愈伤组织诱导；激素；褐化

白芨(Bletilla striata Rchb.f.)为兰科白芨属多年生草本植物[1]，其花色艳丽，具有很高观赏价值.全世界白芨属植物有6种，其中中国就有4种，分别为白芨、小白芨(B.formosana Schltr.)、黄花白芨(B.ochracea Schitr)及华白芨(B.sinensis Schltr.)[2].同时，白芨假鳞茎是一种常用的中药，具有止血收敛、消肿生肌之功效.主治肺结核咯血、支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等症; 外用治外伤出血、烧烫伤、手足皲裂等症[3].现代研究发现，白芨假鳞茎的主要成分白芨胶还具有抑菌、抑癌、促凝血的功效和较强的抗氧化与抗衰老作用[4].由于白芨的药用价值、观赏价值和经济价值，其野生资源遭到过度采挖，加之其自然繁殖率低，生长缓慢，所以野生资源和普通种植已无法满足市场需要.

目前，采用组织培养技术，建立愈伤组织诱导、增殖与分化体系是解决白芨资源短缺的途径之一.关于白芨愈伤组织诱导的研究只见于石云平[5]的一篇文献.本实验利用白芨假鳞茎离体培养，诱导产生愈伤组织，解决诱导过程中外植体褐化与培养基类型选择和激素配比的问题，为白芨的快速繁殖提供一定的理论依据.

1 材料与试剂

1.1 实验材料

白芨，于湖北省金航农业合网络科技有限公司购得.

1.2 实验试剂

本实验采用的White培养基、MS培养基、B5培养基及6-糠氨基嘌(KT)呤均来自北京索莱宝科技有限公司，为分析纯.6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)购自上海中秦化学试剂公司，为化学纯.a-萘乙酸(NAA)购自上海山浦化工有限公司，为化学纯.

1.3 实验主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器；洁净工作台SW-CJ-1F;苏净安泰；电子天平；自动双重纯水蒸馏器；光照培养箱GZMGC-250P.

2 方法与步骤

2.1 外植体消毒灭菌

首先用自来水将白芨假鳞茎上泥沙洗刷干净，并于洗衣粉水中浸泡约1 h，然后用蒸馏水冲洗3遍.在洁净工作台上先用70%酒精消毒30 s，双蒸水冲洗3遍.再用0.1%氯化汞浸泡15 min，双蒸水冲洗3遍.然后切成边长为0.5 cm大小的正方体作为用于接种的外植体备用.

2.2 白芨愈伤组织诱导培养基与激素配比的筛选

将消毒后的外植体分别接种到表1所示的三种培养基上，每瓶接三个外植体,每组做5瓶.植物生长调节剂2,4-D、NAA和6-BA添加量如下L9(34)正交表.培养pH值均调为5.8，含蔗糖3%，琼脂0.7%，活性炭0.2%于(25±1)℃、光照强度1500lx、光照时间12 h/d、光照培养箱中培养，每周记录一次生长状况，九周后记录诱导出愈伤组织外植体块数，统计愈伤组织诱导率.

表1 白芨愈伤组织诱导培养基筛选及激素配比正交设计

愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接入外植体数.

瘦肉精是严重危害畜产品质量安全的一种化学物质。在动物养殖中，需要针对瘦肉精残留的危害性制定针对性的检测技术，确保快速诊断，提高检测效果，杜绝违法案件发生。本次研究的瘦肉精检测卡具有很好的灵敏性，操作简单、检测时间短，在今后畜产品质量瘦肉精残留检测方面，有较好的应用价值。

2.3 外植体的抗褐化

在愈伤组织诱导过程中，采用的2，4-D是植物组培常用合成植物生长素，当它在植物体内累积浓度超过2.0 mg/L时，出现严重的褐化现象[6].实验中将外植体接入添加了1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L活性炭(AC)的MS+6-BA1.5 mg/L +NAA 3.0 mg/L培养基上，以不加活性炭的MS+6-BA1.5mg/L +NAA 3.0 mg/L培养基为对照组，探索白芨愈伤组织诱导及活性炭抗褐化的最佳浓度.

3 结果及分析

3.1 白芨愈伤组织诱导培养基与激素配比的筛选结果

表2 白芨愈伤组织培养激素正交结果分析

从表1可知，相同的激素配比组合，只有MS培养基诱导出了愈伤组织.由表2的分析结果可以看到，最佳的诱导激素配比为6-BA 1.5 mg/L+2, 4-D 3.0 mg/L+NAA 0 mg/L.影响诱导率最大的因素是6-BA浓度.其次是2，4-D浓度.这两种激素对愈伤组织的诱导在一定浓度范围内具有明显的促进作用.NAA对愈伤组织的诱导也具有一定影响，但影响效力要小于6-BA和2,4-D，并且对愈伤组织诱导具有抑制作用.

图1 (MS)培养第三周时的假鳞茎 图2 (MS) 培养第九周时的假鳞茎

如图1所示，培养到三周，我们可以明显看到6号外植体边缘变得不在平齐，并出现透明膨大细胞；当培养到第九周时(如图2)，6号培养基中出现淡黄色致密的愈伤组织，而15号、18号和25号培养基中外植体在第九周时依然处于图1的状态.培养期间由于培养基的消耗，我们继代培养四次.

将外植体接到抗褐化诱导愈伤组织的培养基中，实验结果如表2所示.活性炭在浓度为3 g/L以下时，抗褐化效果随浓度增加而增加，愈伤组织的诱导效果在浓度为1.5 g/L时最好，原因如下：当活性炭浓度低于1.5 g/L时，褐化率较高，不利于诱导愈伤组织；而当活性炭浓度高于1.5 g/L时，褐化率低.但由于活性炭属于多孔结构，具有很强的吸附性，含量过高会大量吸收培养基中的营养物质及激素，外植体缺乏营养物质从而导致组织坏死，将更加不利于愈伤组织诱导.

表3 愈伤组织抗褐化结果

4 讨论

一定量的生长素类物质是植物愈伤组织诱导的必要条件.本实验采用正交设计的方法，通过统计学分析，明确6-BA与2,4-D是获得高质量愈伤组织的关键因子，不过6-BA对愈伤组织诱导的影响更大，这与石云平等[5]白芨愈伤组织诱导、增殖与分化研究结果有所不同.实验还发现，NAA对愈伤组织的诱导具有抑制作用.同时，由于我们选择了2 g/L的活性炭作为抗氧化剂，培养基的有效成分会有一些被活性炭吸附，因此本实验中的6-BA与2,4-D的最佳激素浓度会偏高，同时也降低了NAA对诱导效果的影响.

[1] 药典委员会．中华人民共和国药典：一部[M]．北京：中国医药科技出版社，2010.95.

[2] 石晶.白芨属植物资源与利用[D].海口：海南大学，2010.

[3] 陆俊波,李亚辉,杨永红,孙乐乐,夏翔，等.从文献分析看我国白芨研究进展[J].云南农业大学学报，2011，26(2)：288-292.

[4] 芮海云,吴国荣,陈景耀,等.白芨中性多糖抗氧化作用的实验研究[J].南京师范大学学报(自然科学版),2003, 26(4): 94-98.

[5] 石云平，赵志国，唐凤鸾，等.白芨愈伤组织诱导、增殖与分化研究[J].中草药，2013,28(6)：349-353.

[6] 鲁光耀，杨仙，蒋瑞彬，蒋福升，钱朝东，丁志山.白芨组培快繁体系研究[J].浙江中医药大学学报，2015,39(5)：383-390.

Study on Induction of Bletilla Striata Callus

FU Ying-cong, LI Xiao-qing, WANG Hong-lei, ZHAO Yong-qing*

(College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China)

Objective：In order to study the anti-browning and induction of Bletilla striata callus by taking the false bulbs of Bletilla Striata as tissue culture material. Methods：The medium of MS, B5 and KC were selected as the basic culture medium of orchidaceae respectively. The ratio of growth regulators was adjusted via orthogonal tests. Results：The induction ratio was the maximum of 73.3% when MS medium was used as basic culture medium with 6-BA 1.5 mg/L+NAA 0mg/L+2,4-D 3.0 mg/L. Additionally, addition the activated carbon into the basic culture medium could prevent Bletilla striata browning. The browning rates were 44% and 11% when the contents of activated carbon were 1.5 g/L and 3.0g/L. The induction efficacy of Bletilla striata callus was the highest and least for both contensts respectively. Conclusion：The optimal medium for induction of callus was MS+1.5mg/L of 6-BA+0mg/L of NAA +3.0 mg/L of 2,4-D +2g/L of AC.

False bulbs of Bletilla Striata; Induction of callus; Hormone; Browning

2016-11-02

西北民族大学国家级大学生创新创业训练计划资助项目(项目编号：201610742074).

*

付颖聪(1994—)，女，湖北襄阳人.

S567.239

A

1009-2102(2016)04-0016-04