大孔吸附树脂提取粗壮女贞苦丁茶总黄酮及抗氧化活性

谭 强，缪 睿

(西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州 730124)

大孔吸附树脂提取粗壮女贞苦丁茶总黄酮及抗氧化活性

谭 强，缪 睿

(西北民族大学 化工学院，甘肃 兰州 730124)

目的：研究大孔吸附树脂分离纯化苦丁茶总黄酮的最佳工艺及黄酮化合物的抗氧化活性.方法：采用大孔吸附树脂法获得总黄酮.利用紫外分光光度法测定苦丁茶总黄酮不同浓度下在体外对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除能力.结果：大孔吸附树脂提取最佳工艺为上样流速为3 mL/min,上样浓度为1.2 mg/mL,其黄酮类化合物在体外抗氧化的能力包括ABTS自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基，在不同浓度下的最大清除能力分别为88.65%、87.94%、89.11%和73.21%.结论：总黄酮对4种自由基有良好的清除效果.

苦丁茶; 总黄酮; 抗氧化

贵州粗壮女贞苦丁茶，木犀科属.其在降血脂，降血压，提高免疫力，预防高血压、动脉硬化等方面有很好的效果[1].黄酮类化合物广泛存在于药用植物中，为长期生长过程中的一次代谢产物[2],具有抗菌，抗病毒作用[3]，还具有抗癌作用[4].黄酮类化合物可在食物油中溶解，作为添加抗氧化剂[5].本文采用大孔吸附树脂法提取总黄酮，进行抗氧化活性的探索，并为粗壮女贞苦丁茶的开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

中国药典筛，干燥箱，紫外分光光度计.

1.1.2 材料

粗壮女贞苦丁茶，1,1-二苯基-2-苦基肼DPPH2,2-联氮基-双-(3乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐、大孔吸附树脂.

1.2 方法

1.2.1 大孔吸附树脂的处理

本实验对苦丁茶总黄酮类化合物的分离纯化采用的是D101大孔吸附树脂的方法.加入用95%的乙醇浸泡过的大孔吸附树脂，乙醇应高于树脂表面约30 cm(注：因该装填无气泡)静置24 h后.再用两倍树脂体积的95%的乙醇，以2BV/h的流速通过树脂层，浸泡4 h.再用95%的乙醇洗至流出液与水以1∶5混合不浑浊.再用蒸馏水洗至无醇味，用配置的5%的盐酸浸泡2 h，水洗至中性.最后用配置的2%浓度的氢氧化钠溶液浸泡3 h，水洗至中性，备用.

1.2.2 上样流速的确定

将预处理好的D101大孔吸附树脂装入洗净的玻璃层析柱中，将样品上柱，控制上样流速为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL/min,分步收集每管均6 mL.当流出液的吸光度达到上样液的十分之一，则停止上样，由公式Qc=(C0-Cc) V0/m计算出不同上样液的吸附量.上样流速对吸附量的影响如图1所示.C0为样品物质的初始量；Cc为吸附液中样品物质剩余量；V0为吸附液体积；M为大孔吸附树脂质量.

图1 上样流速对吸附量的影响趋势图

由图1可知，在流速为1.0 mL/min至3 mL/min时呈逐渐上升趋势.在3 mL/min时达到最大值.从3 mL/min到5 mL/min呈现下降趋势.可知上样流速为3 mL/min为最佳流速.

1.2.3 上样浓度的确定

将预处理好的D101大孔吸附树脂装入洗净的玻璃层析柱中，再将苦丁茶提取物配置成不同浓度(0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0mg/L)的样品水溶液进行动态吸附，由公式E =(C0-Cc)C0×100%计算出样品的吸附率.上样浓度对吸附率的影响绘制如图2.C0为黄酮类物质的初始量；Cc为吸附液中黄酮类物质剩余量.

图2 上样浓度对吸附率的影响趋势图

由图2可知，当浓度从0.2 mg/L至1.2 mg/L时，浓度逐渐变大.从1.2 mg/L后，随着浓度的增加吸附率反而下降.从图2可知，当上样液浓度为1.2 mg/L时吸附率最大，所以最佳上样浓度为1.2 mg/L.

1.2.4 不同浓度的乙醇洗脱

上样液浓度为1.2 mg/mL的苦丁茶提取液以3 mL/min的流速加入大孔吸附树脂，先用蒸馏水洗脱5个体积柱.将水溶性杂质除去，再分别用30%至80%的乙醇洗脱5个体积柱(每个梯度增加10%)除去酚类和总皂苷等物质.经检验查证后，70%的洗脱部分为总黄酮，真空干燥后备用.将黄酮溶液配制成1 mg/mL溶液备用.

2 粗壮女贞苦丁茶抗氧化活性的测定

2.1 清除羟基自由基能力的测定

用fenton反应生成羟基自由基，水杨酸可以与羟基自由基结合生成有色的水杨酸化合物，用紫外分光光度计(波长510 nm)测定吸光度，得出清除率，取10 mL容量瓶中加入2 mL 2 mmol/LFeSO4，1 mL 6 mmol/LH2O2，混合均匀后加入4 mL 6mmol/L水杨酸乙醇溶液，用去离子水定容.在37 ℃浴下反应20 min,以去离子水为参比测定吸光度，即为A0.取10 mL容量瓶按照上述再加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的总黄酮溶液，得出Ax.再用蒸馏水替代1 mL 6 mmol/L的H2O2，得出Ax0.计算式：OH清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%，并与Vc做对比得出图3.

图3 苦丁茶总黄酮对羟基自由基清除率

由图3可知，总黄酮溶液清除羟基自由基的能力在1.0 mg/mL下最大.

2.2 清除超氧阴离子能力的测定

取4.5 mL的Tris-Hcl缓冲溶液，加入3 mL去蒸馏水混合均匀后于25 ℃的恒温水浴锅中预热20分钟.再加入邻苯三酚溶液0.4 mL，立即混匀，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的总黄酮溶液，于25 ℃恒温水浴锅中反应4分钟后迅速加入0.1 mL 8 mol/L的盐酸终止反应.用溶剂代替邻苯三酚作为本底对照组A0，用Tris-HCl缓冲溶液代替样品作为空白对照组Ax0，在325 nm波长处测定吸光度Ax.结果见图4.根据公式：超氧阴离子的清除率(%)=[1-((Ax-A0)/Ax0)]×100 %.

图4 苦丁茶总黄酮对超氧阴离子清除率

由图4可知，苦丁茶清除超氧阴离子的能力强于Vc,并在1.0 mg/mL处达到最大值.

2.3 清除DPPH自由基的测定

DPPH(1,1-二苯基-2-苦味阱基)是一种稳定的有机氮自由基，在517 nm处具有最大的吸收波长，DPPH的醇溶液显紫色.取200 μmol/L 3 mL DPPH于10 mL容量瓶中，加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的总黄酮溶液，混合均匀后暗处静置半个小时.同时以无水乙醇代替DPPH溶液作为本底对照Ax0，以无水乙醇代替样品作为空白对照A0.于517 nm处测定吸光度Ax，得出清除率，其计算式：DPPH清除率(%)=[1-((Ax-Ax0)/A0)]*100%.并与VC溶液做对比，得出图5.

图5 苦丁茶总黄酮对DPPH自由基清除率

由图5可知，总黄酮对DPPH自由基的清除率明显弱于Vc,但在高浓度下差别不大.

2.4 清除ABTS能力的测定

总黄酮对 ABTS 自由基清除作用.将 7.0 mmol/L ABTS 溶液与 2.0 mmol/L过硫酸钾混合，暗处静置12 h.将ABTS溶液用95%乙醇稀释40倍后，取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的总黄酮溶液，分别加入4.0 mL ABTS 溶液，振荡30 s，室温下暗反应6 min 后测量在波长 734 nm 的吸光度(A1).1.0 mL总黄酮溶液加入蒸馏水4.0 mL后，测定吸光度( A0) ；4.0 mL ABTS溶液与100 μL丙酮混匀后的测吸光度(A2) .清除率 = [( A2-(A1-A0)]/A2×100% .以Vc为对照，得出图6.

图6 苦丁茶总黄酮对ABTS自由基清除率

由图6可知，两者在高浓度下对ABTS自由基的清除率基本相等.

3 结论

本实验通过大孔吸附树脂法提取粗壮女贞苦丁茶总黄酮，并进行抗氧化活性的实验，并与Vc对比.实验结果说明，粗壮女贞苦丁茶总黄酮对超氧阴离子、DPPH自由基、ABTS自由基随用量浓度的增大而增大，羟基自由基在1.0 mg/mL出现最大值，表现出良好的抗氧化活性，可开发成天然抗氧化剂应用于食品药品中.抗氧化剂可清除自由基，调整和改善人体生理功能，达到预防和治疗慢性疾病的目的[6].大孔吸附树脂法提取粗壮女贞苦丁茶总黄酮的实验具有操作简便、重现性好、再生处理方便，并无重金属污染，有机溶剂毒性残留少的优点[7]，但粗壮女贞苦丁茶的进一步开发还有待深入研究.

[1] 鄢东海.粗壮女贞苦丁茶有益性功能[J].贵州茶叶，2006，(3)：34.

[2] 陈红梅，谢翎.响应面法优化半枝莲黄酮提取工艺及体外抗氧化分析[J].食品科学，2016，37(02)：45.

[3] 苏志维，马仲辉，高成海等.双肾藤根部抑菌成分的筛选研究[J].中药材，2016，39(05)：1057-1061.

[4] 曹冉冉，高嘉屿，刘华清等.皂角刺中二氢黄酮醇类化合物及其细胞毒活性研究[J].中草药，2016，47(05)：707-711.

[5] 金亚香，孙晶，李洪军.大叶苦丁茶抗氧化成分的提取及活性的比较研究[J].食品工业科技，2015，36(04)：151.

[6] 吴奇，朱晨星，樊晓兰等.抗氧化剂与延长寿命的相关性研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2016，30(05)：588-589，591-592.

[7] 胡志军，郝丽君，王南溪等.D-101大孔吸附树脂分离纯化橘皮中的黄酮类物质[J].食品科学，2010，37(08)：69.

Extraction of Total Flavonoid from Ligustrum Lucidum Kudingcha Using Macroporous Adsorption and Its Antioxidant Activity

TAN Qiang, MIAO Rui

(Northwest University for Nationalities, Lanzhou, 730124, China)

Objective：Study on the Optimum Technology of Isolation and Purification of Total Flavonoids from Kudingcha and Antioxidant Activity of Flavonoids by Macroporous Adsorption Resin. Methods：The total flavonoid was extracted utilizing macroporous adsorption resin. The scavenging abilities of DPPH free radical, superoxide anion radical, hydroxyl radical and ABTS free radical in vitro were determined with ultraviolet spectrophotometry. Results：The optimum extraction conditions were as follows: the flow rate was 3mL/min. The loading concentration was 1.2mg/mL. The scavenging abilities of ABTS, DPPH, superoxide anion and hydroxyl radicals in vitro were 88.65%, 87.94%, 89.11% and 73.21%, respectively. The scavenging ability of the flavonoid compounds in vitro was 88.65%.Conclusion：Total flavonoid has good scavenging effects on four kinds of free radicals.

Kudingcha; Total flavonoid; Antioxidant

2016-10-20

谭强(1995—)，男，四川人,主要从事制药工程方面的研究.

R284.2

A

1009-2102(2016)04-0011-05

[基金简介]西北民族大学实验室开放项目.