矮牵牛多倍体诱导试验与快速鉴定

陈 一，李春楠

（杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310016）

文献著录格式：陈一，李春楠.矮牵牛多倍体诱导试验与快速鉴定［J］.浙江农业科学，2016，57（3）：361-363.



矮牵牛多倍体诱导试验与快速鉴定

陈 一，李春楠

（杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310016）

文献著录格式：陈一，李春楠.矮牵牛多倍体诱导试验与快速鉴定［J］.浙江农业科学，2016，57（3）：361-363.

摘 要：用不同浓度的秋水仙素溶液处理矮牵牛种子，结果发现，B3种子经秋水仙素处理后出苗率普遍下降，从存活率上来看，以0.10％浓度处理的种子存活率较高，达到45％以上，在诱导率上各处理随秋水仙素浓度增加略有上升，但差异不明显，结合出苗率、存活率与诱导率，以0.10％秋水仙素处理48 h的效果最佳。流式细胞仪鉴定矮牵牛倍性准确率达96.7％，不仅省时、高效，而且还可以快速、直观地检测出非整倍体，可以用于矮牵牛植株的早期快速倍性鉴定。

关键词：矮牵牛；秋水仙素；流式细胞仪

矮牵牛（Petunia hybrida Vi1m.）原产南美，属茄科，矮牵牛属。因其花大、色彩丰富和花期长等特点而应用广泛，素有“花坛之王”的美誉［1］。自1803年Jusseau确定了矮牵牛属以来，已确定的矮牵牛大约30种。商业上常根据花的大小以及重瓣性将矮牵牛分为大花单瓣类、丰花单瓣类、多花单瓣类、大花重瓣类、重瓣丰花类、重瓣多花类和其他类型（不属于以上类型的均归为其他类型）。20世纪80年代后期，我国沿海地区分别从美国、日本和荷兰等国大量引进栽培，遍布全国各地。目前，市场上对矮牵牛的需求量越来越大，杭州市矮牵牛年用量在2 000万盆左右，是重要的花坛草花之一。

矮牵牛目前国内外普遍栽培的类型有二倍体及四倍体2种倍性［2］。一般二倍体花10 cm以下，而四倍体大花单瓣型花径达10～15 cm，且花期长，花色丰富，是观赏价值较高的盆栽花卉。20世纪50年代初，日本、美国等国家先后人工诱导矮牵牛多倍体获得成功，并培育出许多优美的多倍体类型新品种。秋水仙素是多倍体诱导的有效试剂，为了明确秋水仙素诱导矮牵牛种子适宜的浓度和处理时间，本试验对秋水仙素处理矮牵牛种子的发芽率和存活率做了统计。DNA流式细胞仪测定法是运用流式细胞仪直接测定细胞的DNA含量，从而快速鉴定出植株倍性水平。目前，已被成功地用于甘蓝类［3］、大白菜［4］、青花菜［5］、非洲菊［6］等植株的倍性鉴定上。本试验以矮牵牛为材料，采用DNA流式细胞仪测定法对植株进行了快速鉴定，统计诱导率，以期为矮牵牛染色体倍性的早期鉴定提供一种快速、简易、实用而又可靠的批量检测方法。

1　材料与方法

1.1试验材料

供试材料为杭州市农业科学研究院园艺所矮牵牛高代自交系B3。

1.2多倍体诱导方法

处理方法为种子浸渍法，在培养皿中用秋水仙素水溶液浸泡种子，处理采用0.1％，0.2％，0.3％ 3个浓度梯度，24，48和72 h 3个时间梯度，处理温度为20℃，每个处理种子数量为200粒，取出水洗后，再用蒸馏水浸没24 h，播种于200孔穴盘中，对照采用蒸馏水浸种72 h。

1.3多倍体鉴定方法

用美国Beckman Cou1ter公司生产的DNA流式细胞仪进行分析鉴定。以诱导存活的B3矮牵牛各处理播种苗为材料，切取0.5 cm2嫩叶置培养皿中，加入萃取裂解缓冲液，快速切碎并使碎片完全浸于萃取液中，避光静置萃取2～5 min，再加染色缓冲液快速混匀，避光静置5～8 min，后过滤到样品管内获得单细胞悬浮液。将样品管插入分析仪，约20 s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图。以用根尖染色法鉴定倍性为二倍体（2n =14）B3矮牵牛植株作对照，每个处理测定30株样品，重复2次。随后抽取经DNA流式细胞仪倍性鉴定的植株材料30株，用根尖染色体计数倍性鉴定法进行跟踪分析，分析DNA流式细胞仪鉴定结果准确性。

1.4数据统计

多倍体诱导处理后在育苗温室播种放置，一对真叶期时统计出苗数，计算出苗率，移栽期时统计存活数，计算存活率。统计流式细胞仪鉴定的矮牵牛倍性，计算诱导率。

2　结果与分析

2.1多倍体诱导处理

如表1所示，各处理与对照相比出苗率都有降低。除对照的出苗率达84.0％以外，以0.3％秋水仙素处理72 h的出苗率最高，达71.5％，0.1％秋水仙素处理72 h的出苗率最低，为56.0％。其他各处理的出苗率差异不大，说明不同秋水仙素浓度和处理时间对矮牵牛B3种子的出苗率影响不大。从存活率的结果来看，0.1％秋水仙素的3个不同处理时间下存活率较为接近，在50％左右，其中以48 h处理的存活率最高，达51.5％；0.2％秋水仙素的3个时间处理的存活率分别为43.0％，33.0％和35.0％，均低于0.1％秋水仙素处理；0.3％秋水仙素的3个时间处理的存活率更低，分别为20.5％，23.5％和24.5％。说明不同浓度秋水仙素处理对矮牵牛B3种子的存活率有较大的负作用；在3个不同浓度的处理中，秋水仙素的浓度越高，B3种子的存活率越低，同样浓度的不同处理时间之间B3种子的存活率差别不大，说明秋水仙素的处理时间不是B3种子存活率的主要影响因素。

2.2多倍体鉴定结果

对B3的植株染色体倍性鉴定结果统计如表2所示，分离峰示例如图1所示。随机抽取经DNA流式细胞仪倍性鉴定的植株材料30株，用根尖染色体计数倍性鉴定法进行跟踪分析，其中29株与DNA流式细胞仪鉴定结果一致。说明流式细胞仪测定法的倍性鉴定准确率达到96.7％。从表2可以看出，随着处理浓度的提高，诱导率略有上升，其中0.3％秋水仙素处理24 h的诱导率最高，达30.0％，不同处理时间对诱导率的影响不大。

表2　秋水仙素对矮牵牛B3诱导率的影响

图1　不同倍性矮牵牛流式细胞仪测定的分离峰

在发生诱导的矮牵牛流式细胞仪分离峰图中，有约1/5的样品与对照呈倍性关系（图1），但大部分诱导植株不呈倍性关系，说明在诱导过程中加倍植株不同倍性细胞嵌合产生了混倍体。

3　讨论

试验证明，用秋水仙素水溶液浸渍矮牵牛种子诱导多倍体较易获得成功，但秋水仙素的浓度对矮牵牛种子的发芽与存活有较强的抑制作用，结合出苗率、存活率与诱导率来看，以0.1％秋水仙素处理48 h的效果最好，其存活率达51.5％，为各处理最高，诱导率也达到26.7％。

混倍现象是多倍体诱变中经常出现的现象，在本试验中也得到了证实。诱变种子或幼苗顶端分生组织细胞都是多层细胞，被诱变加倍的可能性不同，也有多倍与未加倍细胞同时存在同一个体中生长发育，因而形成植株的混倍现象。DNA流式细胞仪测定法测定出单个细胞核内DNA含量，且其DNA含量变异可在分布图上直观地看出。测定取

作者简介：陈 一（1982—），男，农艺师，从事花卉育种工作，E-mai1：chenyi17@126.com。

基金项目：杭州市科技计划项目（20130932H04）

收稿日期：2015-10-25

中图分类号：S681.6

文献标志码：B

文章编号：0528-9017（2016）03-0361-03

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160321