结核分枝杆菌菌悬液光密度值与菌落计数的关联性

秦云贺，王艺红，郭庆龙，王洪海，张雪莲

(复旦大学生命科学学院，上海　200438)



·论著·

结核分枝杆菌菌悬液光密度值与菌落计数的关联性

秦云贺，王艺红，郭庆龙，王洪海，张雪莲

(复旦大学生命科学学院，上海200438)

[摘要]目的建立一种基于光密度值计算结核分枝杆菌菌落数的可靠方法。方法利用低频超声和玻璃珠研磨两种方法制备H37Ra菌悬液，菌悬液2倍梯度稀释后，分别测定各个稀释度菌悬液在600 nm处的光密度值(OD600值)，并分析OD600值与稀释倍数曲线，确定最佳的菌悬液制备方法，OD600线性范围，以及OD600值与CFU关联曲线。结果OD600值为0.1～0.6，线性范围内OD600值与稀释倍数线性回归分析结果显示，玻璃珠研磨法和低频超声法相关系数(R2)分别为0.98、1.00，均呈良好的相关性，且低频超声法比玻璃珠研磨法的相关性好，其菌液分散更均匀。OD600值与CFU值线性回归分析结果显示，玻璃珠研磨法和低频超声法回归方程分别是：CFU=2.35×107×OD600+4.42×105、CFU=3.26×107×OD600+6.89×105。结论低频超声法是一种较好的结核分枝杆菌菌悬液制备方法，结合OD600值测定，可成为一种可靠、快速的结核分枝杆菌定量方法。

[关键词]结核分枝杆菌； 菌落形成单位； OD600； CFU； 定量； 低频超声法； 玻璃珠研磨法

[Chin J Infect Control，2016，15(3)：150-154]

结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)引起的传染性疾病，该病已成为危害人类健康的“头号杀手”[1]。近年来，随着卡介苗(BCG)免疫保护力下降[2]、人类免疫缺陷病毒(HIV)全球流行[3]，以及耐药结核病[4](drug-resistant tuberculosis,DR-TB)的出现，使得发现新型免疫保护性抗原、新型抗结核药物，以及细菌与宿主细胞相互作用等结核分枝杆菌基础性研究和相关应用愈加重要，其中药物敏感试验、细胞侵染试验[5]及动物感染实验[6]等均需准确测定结核分枝杆菌的菌量。目前，结核分枝杆菌定量方法主要包括CFU计数法、麦氏比浊法及光密度法[7-8]，CFU计数方法相对准确性高，但周期长，不适用于实际研究中菌液浓度的快速测定；麦氏比浊法是经典的应用于普通微生物浓度测定的方法，该方法用于结核分枝杆菌定量可操作性和重复性差；基于光密度值的定量方法具有简单、便捷、快速的优势，是一种相对实用的定量方法。但由于结核分枝杆菌生长呈颗粒状，菌悬液制备方法以及实验室检测仪器、细菌培养方法等方面的差异，导致该方法缺乏统一的定量标准，需要探索一种简便可靠的方法，便于结核分枝杆菌定量。本研究对比分析低频超声法及玻璃珠研磨法两种菌悬液制备方法，对菌悬液制备方法、菌悬液600 nm处的光密度值(OD600值)与稀释倍数关系、OD600值与CFU关系等进行分析和探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株结核分枝杆菌菌株H37Ra为本实验室保存。

1.1.2仪器和试剂酶标仪(BioTek)、水浴超声仪(Bioruptor Next Gen UCD-300)、涡旋振荡器(SCILOGEX MX-S)、尼康正置荧光显微镜(Nikon)、4.0 mm玻璃珠(复旦大学材料供应中心)、96孔板(上海睿安生物科技有限公司)、Middlebrook 7H9和7H10(Difco)、Tween80和甘油(国药集团化学试剂有限公司)、ADC(0.5%牛血清白蛋白、0.2%葡萄糖、0.85%氯化钠)，所用化学试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1结核分枝杆菌H37Ra的培养用接种环于7H10-10%ADC固体板划线接种H37Ra，37 ℃培养箱中静置培养2～3周，备用。

1.2.2菌悬液制备

1.2.2.1玻璃珠研磨法接种环刮取3环于7H10-ADC固体板上生长2～3周的菌体，转移至含800 μL 液体培养基(7H9、0.05%Tween80、0.5%甘油、10%ADC)的2.0 mL EP管中，加入5粒4.0 mm 磁珠，置于涡旋振荡器上，工作速率调至第三档，涡旋5 min左右。震荡过程中，观察EP管中液体是否充分震悬并随时调整振荡角度，肉眼观察无可见菌块且悬液分散均匀停止振荡，转移至含5.2 mL液体培养基中，静置30 min，取上层菌液，在显微镜下观察玻璃珠处理后菌体分散状况。

1.2.2.2低频超声法接种环刮取3环于Middlebrook 7H10固体板(Middlebrook 7H10、0.5%甘油、10%ADC)上生长2～3周的菌体，转移至含6.0 mL液体培养基中，将菌液分装在无菌2.0 mL EP管中，500 μL/管，水浴超声仪功率调至“LOW”状态，工作15 s，停15 s，共8个循环，勿过度延长超声时间，200 g 10 min低速离心，取上层菌悬液，在显微镜下观察菌液超声处理前后分散情况。

1.2.3CFU计数将制备的菌悬液进行梯度稀释，分别取梯度稀释的菌悬液200 μL涂布Middlebrook 7H10固体板，37 ℃静置培养3～4周，分别计算CFU，每个稀释度的菌悬液接种3个平板。

1.2.4菌悬液光密度值测定

1.2.4.1菌悬液可见光区波长扫描以液体培养基为本底，含适量浓度H37Ra的菌悬液为样品，利用酶标仪扫描其(400～800)nm波长范围内的吸收曲线，间隔为1 nm，并校正光程，通过菌液吸收曲线确定600 nm是否为其较好的吸光度测定波长。

1.2.4.2酶标仪测定菌悬液光密度值分别将两种方法制备的菌悬液进行2倍梯度稀释，连续稀释4个梯度(2、4、8、16倍)并利用酶标仪测定每个稀释梯度λ=600 nm处的光密度值，每个梯度设置3个复孔，每种菌悬液均重复两次。

1.3数据处理所得光密度值均采用均值±标准偏差表示，利用Origin 8.0数据处理软件分析OD600与稀释倍数关系，并确定OD600线性范围；根据CFU计数结果，进行CFU与OD600回归分析。

2结果

2.1菌悬液制备结核分枝杆菌生长易积聚，常规方法不易将其均匀分散，本实验采用两种细菌分散方法对结核分枝杆菌H37Ra株进行处理，结果显示玻璃珠研磨结核分枝杆菌5 min可增加细菌的分散度，但分散细菌团块沉降率较大，需静置30 min；低频水浴超声处理结核分枝杆菌后明显增加菌液的分散度，且低频超声法细菌悬液较为均匀。见图1。

A:未处理；B:玻璃珠研磨法处理后；C:低频超声法处理后

2.2CFU计数将两种方法制备并稀释的结核分枝杆菌菌悬液分别涂布Middlebrook7H10固体培养板，37 ℃培养3～4周后计菌落数，低频超声分散法菌落数比玻璃珠研磨法菌落数多，但两种方法制备的菌悬液在同一稀释倍数下细菌数无数量级差异。

2.3菌悬液可见光区波长扫描图根据测定波长选择原则：选择斜率较小处的波长，以保证其稳定性；具有适当的吸收值，确保其灵敏度，菌悬液在可见光区400～800 nm波长范围内，无最大吸收，菌悬液测定中500～650 nm内测定波长均符合要求，本研究采用600 nm测定波长。见图2。

图2 　可见光区结核分枝杆菌H37Ra的光密度值

2.4OD600值酶标仪测定两种不同稀释梯度的菌悬液OD600值，结果显示两种方法制备的菌悬液吸光值均具有明显的梯度依赖性，其线性相关区间OD600值为0.1～0.6。见表1。线性范围内OD600值与稀释倍数线性回归分析，结果显示玻璃珠研磨法和低频超声法相关系数(R2)分别为0.98、1.00，均呈良好的相关性。见图3。低频超声法制备的菌悬液多次测定结果重复性及稳定性好于玻璃珠研磨法。

表1两种不同稀释梯度结核分枝杆菌菌悬液OD600值

Table 1OD600 ofM.tbsuspension at two different dilution ratios

稀释倍数玻璃珠研磨法低频超声法11.89±0.151.90±0.0920.68±0.070.76±0.0240.37±0.060.37±0.0380.14±0.030.17±0.01160.08±0.010.08±0.01

2.5OD600值与CFU值回归分析对OD600值与CFU值进行线性回归分析，结果显示玻璃珠研磨法和低频超声法回归方程分别是：CFU=2.35×107×OD600+4.42×105、CFU=3.26×107×OD600+6.89×105。

A：玻璃珠研磨法(R2=0.98)；B：低频超声法(R2=1.00)

3讨论

结核分枝杆菌细胞壁脂质含量较高，在液体或固体培养基培养下，细菌均呈颗粒状，因此在进行结核分枝杆菌基础研究和临床药物敏感性测定中，细菌准确定量是一个影响结果稳定性的重要因素。CFU计数、麦氏比浊法、称重法等传统结核杆菌定量方法时间周期长，可操作性及重复性差。分光光度计的操作简单、灵敏度高，测定结果准确度和重复性好，因此紫外-可见分光光度法测定细菌悬液的光密度值成为一种细菌定量的快速、实用的方法，然而结核杆菌呈颗粒状生长的特点使得光密度细菌定量法的稳定性受到很大影响，制定一套标准化的结核杆菌OD600值与CFU关联方法具有重要的应用价值。Peuelas-Urquides等[9]曾对光密度法进行了初步探索，对结核分枝杆菌H37Rv(ATCC27294)CFU值和菌悬液OD600值关联性进行分析，结果显示OD600值为0.39时，其CFU数值为1.97×106/mL。本研究立足于实验室条件，对比分析玻璃珠研磨法和低频超声法两种方法，计算OD600值与细菌CFU计数之间的函数关系，确定了不同制备方法获得的菌悬液光密度值与细菌数量对应关系。

本研究中采用了低频超声法分散细菌，CFU计数结果表明低频率超声不会导致细菌破裂，对结核分枝杆菌活力没有影响，其结果高于玻璃珠研磨法所获得菌悬液CFU数量。与传统的玻璃珠研磨法相比，低频超声法制备的菌悬液分散度高、菌体多单个存在。实验中玻璃珠研磨菌体5 min后采用30 min静置而非离心方法，主要由于玻璃珠研磨后，细菌的颗粒依然比较大，低速离心会严重降低菌悬液中细菌数量。另外，在OD600值测定中，低频超声法具有较高重复性，而玻璃珠研磨法所获得菌悬液沉降较快，同一样品的不同时间测定结果偏差很大。

本实验表明，两种方法均可用于结核分枝杆菌的菌悬液制备，低频超声法比玻璃珠研磨法重复性好、菌体分散良好，在进行结核分枝杆菌基因敲除株、重组株构建等试验制备感受态细菌时，可采用低频超声法获得较为均一的菌悬液，有利于电转外源DNA和后期阳性细菌克隆的筛选；对细菌数量要求较为精确的实验，如药敏试验也可采用低频超声法制备菌悬液。值得注意的是，在使用玻璃珠分散结核分枝杆菌时，要避免因菌悬液沉降较快，而导致同一样品不同时间测定结果之间的偏差。同时由于各个实验室使用的振荡器或水浴超声仪的型号不同，在制备菌悬液时，需要根据仪器震荡或超声频率的不同，调整制备菌悬液的具体操作时间和频率。

结核分枝杆菌的准确定量具有重要的研究意义，本研究中所采用的OD600值与CFU关联方法具有普遍适用性，低频超声法可操作性和重复性好，可以为各个实验室建立基于OD600值的结核分枝杆菌定量标准提供重要的参考。

[参 考 文 献]

[1]Paulson T. Epidemiology: a mortal foe[J]. Nature, 2013, 502(7470): S2-S3.

[2]Nankabirwa V, Tumwine JK, Mugaba PM, et al. Child survival and BCG vaccination: a community based prospective cohort study in Uganda[J]. BMC Public Health, 2015, 15: 175.

[3]World Health Organization. Global tuberculosis report 2014[M].WHO, 2014.

[4]Udwadia ZF, Amale RA, Ajbani KK, et al. Totally drug-resistant tuberculosis in India[J]. Clin Infect Dis, 2012, 54(4): 579-581.

[5]Mishra BB, Rathinam VA, Martens GW, et al. Nitric oxide controls the immunopathology of tuberculosis by inhibiting NLRP3 inflammasome-dependent processing of IL-1β[J]. Nat Immunol, 2013, 14(1): 52-60.

[6]王应辉, 王洪海，曹健，等. 潜伏性结核分枝杆菌感染动物模型[J]. 中国感染控制杂志, 2011, 10(4): 312-315.

[7]Iona E, Giannoni F, Pardini M, et al. Metronidazole plus rifampin sterilizes long-term dormantMycobacteriumtuberculosis[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(4): 1537-1540.

[8]Taneja NK, Tyagi JS. Resazurin reduction assays for screening of anti-tubercular compounds against dormant and actively growingMycobacteriumtuberculosis,MycobacteriumbovisBCG andMycobacteriumsmegmatis[J]. J Antimicrob Chemother, 2007, 60(2): 288-293.

(本文编辑：豆清娅)

Correlation between optical density and colony forming units ofMycobacteriumtuberculosissuspension

QINYun-he,WANGYi-hong,GUOQing-long,WANGHong-hai,ZHANGXue-lian

(SchoolofLifeScience,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a reliable approach for quantification of colony forming unit(CFU) of Mycobacterium tuberculosis(M.tb) by measuring optical density(OD).MethodsM.tb suspension H37Ra was prepared using low-power ultrasonic or glass bead beating methods, and was two-fold serially diluted, OD at 600nm (OD600) of each dilution ratio was measured respectively, OD600 and dilution curve were analyzed to determine the optimum approach for preparing bacterial suspension，linear range of OD600, as well as linear relationship between OD600 and CFU.ResultsOD600 was 0.1-0.6, linear regression analysis of OD600 and dilution ratio within linear range revealed that correlation coefficient (R2) of glass bead beating and low-power ultrasonic methods were 0.98 and 1.00 respectively，both presented a good correlation, low-power ultrasonic method was better than glass bead beating method, bacterial suspension dispersed more evenly. Linear regression analysis results of OD600 and CFU values showed that the regression equation of glass bead beating method and low-power ultrasonic method were CFU=2.35×107×OD600+4.42×105 and CFU=3.26×107×OD600+6.89×105 respectively.ConclusionLow-power ultrasonic method is a good method for preparation of M.tb suspension，combined the measurement of OD600 value， it can be a reliable and rapid method for quantitative analysis of M.tb.

[Key words]Mycobacterium tuberculosis; colony forming unit； OD600； CFU； quantification; low-power ultrasonic method; glass bead beating method

[中图分类号]R378.91+1

[文献标识码]A

[文章编号]1671-9638(2016)03-0150-05

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.03.002

[作者简介]秦云贺(1988-)，男(汉族)，河南省新乡市人，硕士，主要从事新型抗结核药物发现和机制研究。[通信作者]张雪莲E-mail：xuelianzhang@fudan.edu.cn

[基金项目]上海市科技支撑项目(15431900200)

[收稿日期]2015-07-25