盐酸多西环素临床治疗异育银鲫嗜水气单胞菌感染的给药方案的制定

邴晓菲，孙朋辉，王　浩，吕利群

(国家水生动物病原库，农业部淡水种质资源重点实验室，

上海海洋大学水产与生命学院，上海　201306)



盐酸多西环素临床治疗异育银鲫嗜水气单胞菌感染的给药方案的制定

邴晓菲，孙朋辉，王浩，吕利群

(国家水生动物病原库，农业部淡水种质资源重点实验室，

上海海洋大学水产与生命学院，上海201306)

摘要：通过高效液相色谱法(HPLC法)测定盐酸多西环素在异育银鲫(Carassius auratus gibelio)血清中不同时间点的血药浓度，并结合药物的体外药效学参数，确定该药的临床给药方案。结果显示，盐酸多西环素对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，AH10)的最小抑菌浓度(MIC)为0.4 μg/mL，最小杀菌浓度(MBC)为3.2 μg/mL，防耐药突变浓度(MPC)为4.8 μg/mL，耐药选择窗(MSW)为0.4～4.8 μg/mL。盐酸多西环素的抗菌后效应(PAE)约为2 h；在异育银鲫中能够达到良好的抑菌杀菌效果的盐酸多西环素口灌剂量是20 mg/kg，休药期至少为25 d；能够控制耐药菌株产生的盐酸多西环素口灌剂量是80 mg/kg，休药期至少为60 d。

关键词：盐酸多西环素；异育银鲫(Carassius auratus gibelio)；嗜水气单胞菌(A.hydrophila)；药效动力学；药代动力学

异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)是中国常见经济型淡水鱼，近年来集约化养殖导致细菌性疾病肆虐，其中嗜水气单胞菌能广泛引起淡水鱼类的细菌性败血症，被认为是引发传统池塘养殖鱼类爆发性疾病的最重要病原[1]。嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila，AH10)是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性菌，感染鱼体后先在肠道内增殖，再经门动脉循环进入肝脏、肾脏及其它组织，引起肝脏、肾脏等器官以及血液病变，继而出现全身症状。AH10在鱼体疾病感染中属中等致病菌，代表性突出，研究价值高。

1材料与方法

1.1试验鱼

试验用健康异育银鲫购自上海金山养殖场，平均体重(200±50)g，试验期间暂养于实验室0.4 m×0.5 m×1 m的水族箱里，水温控制在(20±1)℃。

1.2材料与仪器

盐酸多西环素原料药(纯度≥98%)、盐酸多西环素标准品(阿拉丁-D111942)、Muller-Hinton(MH)培养基、乙腈(HPLC)、甲醇(HPLC)、草酸(A.R)、十二水合磷酸氢二钠(A.R)、柠檬酸一水物(A.R)、EDTA·2Na(A.R)均购自上海国药集团化学试剂有限公司。Agilent 1100高效液相色谱仪；漩涡振荡器；高速离心机；恒温水浴锅等。

EDTA-McIlvaine 缓冲液：称取0.60 g 十二水合磷酸氢二钠、0.52 g 柠檬酸一水物、0.15 g EDTA·2Na溶于40 mL纯净水中。

1.3试验菌株

嗜水气单胞菌AH10，由上海海洋大学国家水生动物病原库分离保存。

1.4盐酸多西环素对AH10的体外药效学指标测定

1.4.1最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

采用平板划线法挑取单个菌落于MH肉汤中过夜培养至菌液浓度为106CFU/mL，用该菌液分别稀释药物浓度为128、12.8、6.4……0.025 μg/mL，于30 ℃恒温摇床中培养24 h，无菌落生长的药物浓度即为MIC，继续培养24 h后涂板，菌落数小于5的药物浓度即为MBC。重复试验5次，取平均值即为MIC和MBC值。

1.4.2防耐药突变浓度(MPC)和耐药选择窗(MSW)

平板划线法培养单个菌落，挑取单个菌落于MH肉汤中过夜培养，然后3 000 r/min离心后剔去肉汤，重加10倍原MH肉汤，震荡培养6 h，同样离心后剔除肉汤并将菌液稀释到3×1010CFU/mL。采用琼脂平板法[6]，配制药物浓度分别为2 MIC、4 MIC、6 MIC、8 MIC、10 MIC、12 MIC、14 MIC的琼脂平板，取0.1 mL 3×1010CFU/mL菌液分别涂布到上述各含不同药物浓度的琼脂平板上，使总接种量达1.2×1010CFU，于30 ℃恒温箱中孵育72 h，没有菌落生长的最低药物浓度即为MPC，重复操作5次，取平均值即为MPC的值。MIC和MPC之间的浓度范围即为MSW。

1.4.3抗菌后效应(PAE)

参考刘远飞[7]方法，配制分别含有10 MIC、20 MIC、40 MIC药物浓度的药液0.2 mL和浊度为106CFU/mL菌液1.8 mL作为试验组T1、T2、T3，同样方法配制0.8 MIC和0 MIC作为对照组C1、C2。将两组都置于30 ℃恒温水浴中孵育2 h。采用400倍除药法，分别取0.1 mL的上述试验组和对照组的混合液加入到1.9 mL肉汤中，同样方法再稀释一次，然后置于30 ℃恒温摇床中孵育，此时设为PAE的零时。分别在0～8 h的整时间点对各菌液进行系列稀释计数，重复试验3次，每个时间点取平均值建立细菌恢复生长曲线，根据公式PAE=T-C，得PAE值，其中T、C分别为细菌菌液浓度高于零时10倍所需时间。

1.5盐酸多西环素在异育银鲫体内的药动学研究

1.5.1给药和采样

将异育银鲫分成五组，每组按20、30、70、80 mg/kg的药物剂量单次口灌入异育银鲫前肠，观察无回吐者用于试验。分别在给药第0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、24、48、72、120、192、240、480 h自尾静脉取血液、肌肉样品，重复5次，并取空白样品作为对照。血液样品于4 ℃冰箱中静置8～10 h，4 000 r/min离心得血清于离心管中，血清和肌肉同置于-20 ℃保存待处理。

1.5.2色谱条件

参考符华林等[8]HPLC色谱条件。色谱柱：RP-ODSC18分析柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈∶甲醇∶0.01 mol/L草酸溶液=2∶1∶7(V/V/V)；流速：0.8 mL/min；紫外检测波长：346 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

1.5.3样品预处理

参考符华林等[8]血清样品处理方法，血清(肌肉)解冻后取500 μL(1 g)于15 mL离心管中，加入200 μL EDTA-McIlvaine 缓冲液，2.0 mL甲醇，涡旋混匀1 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液于50 mL离心管中，置于通风厨中50 ℃水浴蒸干，加入500 μL流动相复溶，经0.22 μm有机相一次性针头过滤器过滤，20 μL进样分析。

1.5.4标准曲线的绘制

准确称取0.01 g盐酸多西环素标准品，溶解于10 mL流动相中，配制成浓度为1 mg/mL盐酸多西环素溶液，并用流动相稀释成200、100、20、10、5、1、0.25、0.025 μg/mL系列浓度的药液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样分析，每个浓度做3个平行测定。建立标准曲线，得回归方程及相关系数。

1.5.5回收率和精密度

配制200、20、2 μg/mL标准液，取解冻空白血清400 μL，加入100 μL标准液，按上述样品处理方法进行处理，最终复溶后的理论药液浓度为100、10、1 μg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤后，进行HPLC测定。每个浓度做3个平行测定，根据实测浓度和理论浓度计算相对回收率。日内做5个重复，一周内做5个重复，计算日内平均变异系数和日间平均变异系数。

1.5.6数据处理

经Agilent 1100高效液相色谱仪测定得到的数据，用Excel处理数据，用Kinetic 4.4 药代动力学软件拟合动力学模型，得到相关动力学参数及方程式。

2结果

2.1盐酸多西环素体外药效学研究结果

盐酸多西环素对嗜水气单胞菌AH10的MIC为0.4 μg/mL，MBC为3.2 μg/mL，MPC为4.8 μg/mL，MSW 为0.4～4.8 μg/mL；嗜水气单胞菌AH10与浓度分别为1 MIC、2 MIC、4 MIC的盐酸多西环素药液接触1 h后的PAE分别为(1.25±0.11)、(1.73±0.10)、(2.62±0.15)h。由图1可知，去除药物后，0 MIC和0.08 MIC药物浓度的曲线几乎重合，说明400除药法可以去除药物；在1～4 MIC范围内，随着盐酸多西环素药物浓度升高PAE逐渐延长。

图1　盐酸多西环素和AH10接触1 h后，

2.2盐酸多西环素在异育银鲫体内药代动力学研究结果

2.2.1标准工作曲线

本研究以盐酸多西环素浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，建立标准工作曲线(图2)，在0.05～200 μg/mL范围内线性关系良好，Y=34.54X-7.5，r=0.999，最低检测限为0.05 μg/mL。

图2　盐酸多西环素标准工作曲线

2.2.2回收率和精密度

应用1.5.3的样品处理方法得到盐酸多西环素在异育银鲫血清中的平均回收率为90.74%，日内平均变异系数为2.38%，日间平均变异系数为3.22%。说明异育银鲫血清的处理方法精密度高，符合要求。

2.2.3盐酸多西环素在异育银鲫血清中的代谢规律

由图3可知，给异育银鲫口灌不同剂量的盐酸多西环素24 h内血清中药物浓度变化趋势基本一致，呈现出明显的双峰现象。一次性口灌剂量为20 mg/kg和30 mg/kg盐酸多西环素药物时分别在1 h、6 h和0.5 h、6 h出现峰值，且峰值分别为(2.43±0.12)μg/mL、(4.16±0.13)μg/mL和(1.9±0.7)μg/mL、(3.2±0.12)μg/mL，口灌剂量为20 mg/kg时异育银鲫血清中盐酸多西环素浓度维持在MIC之上的时间是23 h，外加PAE的2 h，总维持时间是25 h，口灌剂量为30 mg/kg时异育银鲫血清中的盐酸多西环素浓度维持在MIC之上的时间远远超过24 h。

异育银鲫口灌剂量为70 mg/kg和80 mg/kg盐酸多西环素时血清中药物浓度分别在0.5 h、4 h和0.25 h、4 h达到峰值，且峰值分别为(7.53±0.13)μg/mL、(6.5±0.15)μg/mL和(11.41±0.12)μg/mL、(10.2±0.09)μg/mL。在70 mg/kg和80 mg/kg这两个口灌剂量中，异育银鲫血清中盐酸多西环素浓度24 h内维持在MPC之上的是80 mg/kg的口灌剂量。

图3　口灌不同剂量盐酸多西环素在异育银鲫血清中

2.2.4盐酸多西环素在异育银鲫血清中PK参数

将不同口灌剂量下异育银鲫血清中盐酸多西环素随时间变化的数据输入Kinetic 4.4软件进行房室模型拟合，结果显示，均符合一级吸收二室模型。参数见表1、表2。

2.2.5PK-PD联合参数确定给药方案

参考PK-PD联合参数确定给药方案即参考AUC24/MIC和Cmax/MIC的值。结果显示，口灌剂量分别为20、30、70、80 mg/kg时异育银鲫血清中盐酸多西环素浓度随时间变化曲线下得到的AUC24/MIC为84.22、93.01、240.48、359.10，Cmax/MIC为6.08、10.40、18.83、28.53。

表1　口灌不同剂量盐酸多西环素在

注：Ka：吸收速率常数；Kel：药物在中央室的消除速率常数；K12：由中央室到周边室的一级转运速率常数；α：分布速率常数；β：消除速率常数；A：分布相零时截距；T1/2α:吸收半衰期；T1/2β：消除半衰期；B：消除相零时截距；Tmax：达峰时间；Cmax：达峰浓度；AUC：药时曲线下总面积；AUC24：0～24 h内药时曲线下面积

表2　口灌不同剂量盐酸多西环素在异育银鲫血清中

按欧盟和中国规定的强力霉素在可食组织肌肉中最高残留限量(MRL)300 μg/kg计算休药期[2]。研究结果显示，异育银鲫口灌剂量20 mg/kg时肌肉中盐酸多西环素浓度在12 h到达峰值为(1.25±0.08)μg/g，在给药第20、25 d肌肉中盐酸多西环素浓度分别为(0.32±0.10)、(0.25±0.05)μg/g(图4)。异育银鲫口灌剂量80 mg/kg时肌肉中盐酸多西环素浓度在10 h到达峰值为(2.74±0.14)μg/g，在给药第50、60 d肌肉中盐酸多西环素浓度分别为(0.28±0.03)、(0.25±0.04)μg/g(图4)。因此，为达到国家规定最大残留限量300 μg/kg，异育银鲫口灌剂量分别为20、80 mg/kg时的休药期至少为25 d和60 d。

图4　异育银鲫口灌不同剂量盐酸多西环素

3讨论

由药效学结果可知，盐酸多西环素对嗜水气单胞菌AH10具有较好的抗菌活性，但MSW的跨度较大，水产动物用药后体内药物浓度很容易落在这个跨度内，因此，细菌产生耐药性的可能性也会加大；PAE会随着药物浓度的升高呈现出明显的延长趋势，在实际用药中可适当延长用药间隔大约2 h。由药代动力学参数可知，盐酸多西环素在异育银鲫血清中吸收较快，消除缓慢，这可能与盐酸多西环素同蛋白的结合率有关。Majewski[9]指出，盐酸多西环素与血浆蛋白结合率为82%～95%，而四环素只有65%。

异育银鲫口灌不同剂量盐酸多西环素血清中药时曲线呈现明显的双峰现象，这一现象同彭新亮等[3]的研究结果一致，丁俊仁[2]的研究结果则未出现双峰现象。有关双峰现象曾有过不少研究报道，彭新亮等[3]认为出现双峰现象的可能原因是某部位对药物吸收存在重吸收作用，肝肠循环是最具有可能的一种机制。周怀梧[10]的研究中也有相同的解释。同时，是否出现双峰现象还可能与药物的种类和动物种属差异有密切关系，此外采样点的设定和分析模型的选择对于双峰及多峰现象的出现亦有一定的影响[11]。

在传统的PK-PD联合参数的基础上，近年来提出的MSW、MPC的理论进一步补充了抗菌药物临床用药的评定标准，有利于提高抗菌药的用药效果，为临床提供有价值的用药建议[12]。XU等[13]、李梦影等[14]应用MPC、MSW理论并结合体内药代学参数制定不同抗生素的用药方案。丁运敏[15]研究指出，强力霉素对嗜水气单胞菌的药效与药物浓度关系密切。当Cmax/MIC>3.96和AUC24/MIC>77.28时，强力霉素能够对嗜水气单胞菌起到持续的抑制作用。本实验结果中，同时基于异育银鲫血清中血药浓度24 h内维持在MIC之上的最低给药剂量是20 mg/kg，且浓度依赖性药物适宜每日1次给药[16]。石焕阶[17]的研究中指出，浓度依赖型药物AUC24/MIC>125，Cmax/MIC>8时不但起效快，且有效杀灭细菌和抑制耐药菌株产生，临床有效率可>90%，故应该大剂量每日1次给药。研究结果显示，异育银鲫口灌剂量为70、80 mg/kg时能满足以上条件，同时，基于异育银鲫血清中血药浓度24 h内维持在MPC之上的最低给药剂量是80 mg/kg。因此，水产养殖中，如果选用盐酸多西环素作为治疗异育银鲫细菌性败血症的抗生素药物，建议的用药方案是首次用药按20 mg/kg剂量，每日一次给药，休药期不低于25 d。由于实验结果显示的MSW跨度较大，再次用药很容易产生耐药菌株，因此，再次用药建议的用药方案是每日一次80 mg/kg剂量给药，休药期不低于60 d。

参考文献：

[1]曹军,冯学芝,冯展波,等.大黄鱼致病菌嗜水气单胞菌的分离与鉴定[J].湖北农业科学,2007,46(5):888-890.

[4]彭新亮,刘锦妮,何斌.不同水温下多西环素在草金鱼体内的药代动力学[J].畜牧与兽医,2014,46(6):83-86.

[5]陈红,李智丽.曾振灵.多西环素在健康奥尼罗非鱼的药物代谢动学研究[C].2008年中国水产学会学术会,2008.

[6]催俊昌,刘又宁,王睿,等.左氧氟沙星药代动力学/药效动力学参数与金黄色葡萄球菌耐药的相关性研究[J].中国临床药理学与治疗学,2007,12(9):989-992.

[7]刘远飞.氟喹诺酮类抗菌药后效应及其机制的研究[D].哈尔滨:东北农业大学动物医学院,2002.

[8]符华林,张莉,张伟.盐酸多西环素微囊制备及其在家兔体内的药动学研究[J].畜牧兽医学报,2011,42(10):1438-1444.

[9]Majewski M.A current opinion on the safety and efficacy of doxycycline incloding parenteral administration-A review[J].Pol Ann Med,2012,(21):57-62.

[10]周怀梧.药物吸收多峰现象的动力学研究[J].现代应用药学,1989,6(2):37-40.

[11]鞠晶.磺胺间甲氧嘧啶在罗非鱼体内的药代动力学及残留规律[D].上海:上海海洋大学,2014.

[12]李晓琳.抗菌药物的药动学和药效学参数对临床用药的意义[J].河北医药,2014,(4):64-69.

[13]Xu L,Wang H,Yang X,et al.Integrated pharmacokinetics/pharmacodynamics parameters-based dosing guidelines of enrofloxacin in grass carpCtenopharyngodonidellato minimize selection of drug resistance[J].BMC Vet Res,2013,9(1):1-10.

[14]李梦影,徐丽娟.氟苯尼考在鲫和草鱼体内的药代/药效动力学联合参数及其临床给药方案的研究[J].水产学报,2014,38(6):888-895.

[15]丁运敏.强力霉素对嗜水气单胞菌药动-药效同步模型的研究[D].武汉：华中农业大学,2011.

[16]李云景,邢洁,陈文娟.时间依赖性抗菌药与浓度依赖性抗菌药给药方案的优化[J].中国现代药物应用,2008,2(24):72-73.

[17]石焕阶.根据浓度依赖型与时间依赖型抗菌药物的特点制定给药方案[J].医药导报,2009,28(9):1222-1223.

(责任编辑：邓薇)

Principles for drawing medication regimen of doxycycline hydrochloride against Aeromonas hydrophila infection in Carassius auratus gibelio

BING Xiao-fei,SUN Peng-hui,WANG Hao,LV Li-qun

(NationalPathogenCollectionCenterforAquaticAnimals/KeyLaboratoryofFresheryGermplasmResources/CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：We determined the concentration-time curves of serum doxycycline hydrochloride at several different time points post drug-dosing by high performance liquid chromatography (HPLC).The results showed that the MIC of doxycycline hydrochloride on Aeromonas hydrophila,AH10 was 0.4 μg/mL,the MBC was 3.2 μg/mL,the MPC was 4.8 μg/mL,the MSW was between 0.4 μg/mL and 4.8 μg/mL,PAE was around 2 h;the recommended oral dosage of doxycycline hydrochloride was a dose of 20 mg/kg that could achieve good bactericidal effect with a withdraw time of 25 d.To prevent the induction of drug-resistant AH10,an oral dosage of 80 mg/kg was recommended for disease control,which was accompanied with a withdraw time of 60 d.

Key words：doxycycline hydrochloride;Carassius auratus gibelio;Aeromonas hydrophilo;pharmacodynamics;pharmacokinetic

中图分类号：S943.117.42

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)02-0045-05

作者简介：第一邴晓菲(1990-)，女，硕士研究生，水产动物代谢组学。E-mail：sdqdbxf@163.com通讯作者：吕利群。E-mail：lqlv@shou.edu.cn

收稿日期：2015-05-07；

修订日期：2015-09-02

资助项目：现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-46-12)