罗非鱼无乳链球菌巢式PCR检测方法的建立

邵　辰，易　弋，黎　娅，黄　荷，伍时华，杨　军

(1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州，545006；

2.广西糖资源绿色加工重点实验室(广西科技大学)，广西柳州，545006；

3.广西高校糖资源加工重点实验室(广西科技大学)，广西柳州，545006;

4.柳州市渔业技术推广站，广西柳州，545006)



罗非鱼无乳链球菌巢式PCR检测方法的建立

邵辰1,2,3，易弋1,2,3，黎娅1,2,3，黄荷1,2,3，伍时华1,2,3，杨军4

(1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西柳州，545006；

2.广西糖资源绿色加工重点实验室(广西科技大学)，广西柳州，545006；

3.广西高校糖资源加工重点实验室(广西科技大学)，广西柳州，545006;

4.柳州市渔业技术推广站，广西柳州，545006)

摘要：根据无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)cfb基因序列，设计、合成2对引物，优化扩增条件，建立了快速高灵敏度鉴别无乳链球菌的巢式PCR方法。结果显示：使用该方法对罗非鱼(Oreochromis mossambicus)血液样品进行检测，可检测到活菌浓度为8.7×104 CFU/mL的无乳链球菌。对采自广西地区受无乳链球菌感染的19份罗非鱼样品进行检测，18份可获得目的片段，扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列，检测准确度达到94.7%。

关键词：巢式PCR;无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；cfb基因；罗非鱼(Oreochromis mossambicus)

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是水产养殖中常见的病原菌。世界水产业每年因无乳链球菌病造成的损失均高达100亿美元[1,2]。至今为止，发现有30多种养殖类淡水鱼和50多种海水鱼容易受到无乳链球菌的感染[3]，其中以罗非鱼最易受到该病菌的入侵[4]。无乳链球菌病发病较快，除一部分急性死亡外，并没有明显的症状[5]，因此从发病鱼的症状上很难判断病原菌的种类，从而对疾病的有效处理产生影响[6,7]。目前关于罗非鱼无乳链球菌的检测主要依靠的是病原菌的分离和生理生化鉴定等方法[8]，这些方法操作繁琐、检测周期长，不能达到快速鉴定的目的[9，10]。分子鉴定具有快速、简便以及灵敏度高的优点，是微生物鉴定的发展趋势。虽然有关无乳链球菌的分子检测方法国内外已有报道[4，11]，但多数是利用纯培养的菌液进行检测，直接使用受感染组织作为模板进行分子检测的研究还未见报道。本研究采用巢式PCR检测无乳链球菌，大大提高了检测灵敏度，实现了以血液为样本直接检测，为无乳链球菌病的预防和治疗奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

无乳链球菌(Streptococcusagalactiae) 7-7s，甘油保种， -20 ℃保存，由广西科技大学发酵工程研究室提供。

1.1.2培养基

脑心浸出液肉汤(BHI)：购于北京陆桥技术有限公司，配制方法参考产品说明书。

1.1.3细菌的培养

取甘油保藏的无乳链球菌10 μL接种于10 mL的BHI培养基，37 ℃培养24 h备用。

1.2方法

1.2.1引物的合成与设计

根据GenBank中无乳链球菌cfb基因的序列设计引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。合成后将引物稀释成10 mmol/L的母液-20 ℃保存。引物序列如下：

PcfbA (5′-TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3′)

PcfbS (5′-CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3′)

CFBAb (5′-CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC-3′)

CFBSb (5′-ATGATGTATCTATCTGGAACTCT

AGTG-3′)

1.2.2PCR扩增

1.2.2.1外侧扩增体系

使用引物PcfbA和PcfbS对无乳链球菌菌液进行PCR扩增。PCR反应体系：2×TaqPCR Master Mix(购自天根生化科技有限公司)12.5 μL，浓度为10 μmol/mL的引物PcfbA和PcfbS各1 μL，无乳链球菌菌液1 μL，加双蒸水补足25 μL。

扩增反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.2.2内侧扩增体系

以外侧扩增产物为模板，使用引物CFBAb和CFBSb进行第二轮PCR扩增。

PCR混合液组成：2×TaqPCR Master Mix (购自天根生化科技有限公司)12.5 μL，10 μmol/mL引物CFBAb和CFBSb各1 μL，第一轮PCR产物1 μL，加双蒸水补足25 μL。

扩增反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR完成后经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.3PCR条件的优化

分别使用50、53、55、57、59和61 ℃作为PCR反应的退火温度，按1.2.2的方法进行PCR扩增，确定最佳的退火温度。

1.2.4巢式PCR特异性实验

分别用无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)、路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)、志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、简达气单胞菌(Aeromonasjandaei)菌液作为模板，按上述反应体系和反应条件进行PCR扩增，1%琼脂凝胶电泳分析特异性结果。

1.2.5灵敏度实验

将无乳链球菌菌液稀释至8.7×107、8.7×106、8.7×105、8.7×104、8.7×103、8.7×102、8.7×101和8.7×100CFU/mL 8个不同的浓度，采用上文所述的方法进行巢式PCR。在15和30次之间调整PCR的循环次数，以灵敏度为指标，优化循环次数。同时以ddH2O替代模板作为阴性对照。

1.2.6重复性实验

配制活菌浓度为8.7×105CFU/mL的样品，重复检测7次，同时设置阴性对照，以验证实验方法的重复性。

1.2.7血液样品的检测

从健康罗非鱼尾部抽取新鲜血液，与新鲜无乳链球菌菌液按比例混合，配制成活菌浓度分别为8.7×107、8.7×106、8.7×105、8.7×104、8.7×103、8.7×102、8.7×101和8.7×100CFU/mL的血液样品。利用所优化的方法对血液样品进行检测，判断检测灵敏度。

1.2.8临床检测实验

自农户处取得患病罗非鱼，从鱼尾抽取鱼血作为模板，使用巢式PCR进行检测，判断其是否感染无乳链球菌。并对该鱼的脑肝脾肾心等器官进行采样，分离鉴定病原菌，判断与巢式PCR检测结果是否一致。

2结果

2.1巢式PCR扩增及反应条件的优化

分别对cfb基因的两对引物的退火温度进行优化。结果显示，当退火温度在55 ℃左右时，第一轮PCR在1 000 bp附近(图1a)，第二轮PCR在260 bp附近(图1b)有较为清晰的条带，无拖尾现象。

图1　巢式PCR扩增温度梯度优化

a第一轮扩增，b第二轮扩增;M.DNA分子质量标准;1.Tm=50 ℃；2.53 ℃;3.55 ℃;4.57 ℃;5.59 ℃;6.61 ℃

2.2特异性实验

对已采集到的多种罗非鱼致病菌，与无乳链球菌同时进行巢式PCR，作为特异性实验验证其引物的特异性。实验结果显示，无乳链球菌条带清晰，大小正确；而其他菌株及阴性对照均未扩增出任何条带(见图2)。说明该实验能够从对罗非鱼致病的多种细菌中特异性的区分出无乳链球菌，而不会与其他的致病菌混淆。

图2　PCR反应特异性实验

a第一轮扩增，b第二轮扩增；M.DNA 分子质量标准;1.无乳链球菌(Streptococcusagalactiae);2.阴性对照(negative control);3.金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus);4.嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila);5.摩氏摩根菌(Morganellamorganii);6.维氏气单胞菌(Aeromonasveronii);7.路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii);8.志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides);9.苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis);10.简达气单胞菌(Aeromonasjandaei)

2.3灵敏度实验

根据1.2.5中所述的方法，对巢式PCR的灵敏度进行了试验，结果见表1。多次实验结果显示在第一轮25次循环和第二轮25次循环时，巢式反应能得到最高的灵敏度。再增加反应次数会导致阴性对照出现假阳性条带，而降低反应次数会导致反应灵敏度下降。因此，选择第一轮和第二轮均为25次循环进行后续实验。

2.4重复性实验

重复性实验中，7次反应均能在260 bp附近扩增出清晰条带(见图3)，而阴性对照均无扩增产物，说明本方法重复性较好。

表1　巢式PCR灵敏度实验

图3　巢式PCR重复性实验

M.DNA 分子质量标准;1.无乳链球菌7-7-小;2.无乳链球菌001;3.无乳链球菌002;4.无乳链球菌003;5.无乳链球菌004;6.无乳链球菌005;7.无乳链球菌006;8.阴性对照

2.5血液样品灵敏度实验

按1.2.7所述方法配制含无乳链球菌的罗非鱼血液样品，采用优化后的方法进行巢式PCR扩增，结果显示当血液中无乳链球菌含量大于8.7×104CFU/mL时，均能扩增得到目的条带(图4)。

图4　血液样品灵敏度实验

M.DNA 分子质量标准;1-8.无乳链球菌含量分别为 8.7×107、8.7×106、8.7×105、8.7×104、8.7×103、8.7×102、8.7×101、8.7×100CFU/mL的血液样品;9.阴性对照

2.6临床检测实验

自柳州市三千村的农户处取得患病罗非鱼，抽取血液进行检测，得出阳性结果，阴性对照未出现条带(图5)。同时从患病罗非鱼的脑肝脾等器官中分离出了无乳链球菌，与PCR检测结果一致。从2014年5-8月，在广西桂中地区共采集到患病罗非鱼样品29份，其中有19份感染无乳链球菌。在这19份样品中18份获得目的片段，扩增到的序列均为无乳链球菌cfb基因序列，检测准确度达到94.7%。

图5　临床检测结果

3讨论

毒力因子及其相关基因是致病菌的特有基因，现在已经广泛地应用于水生动物致病菌的快速检测[12-14]。cfb基因是无乳链球菌的特有基因，它能编码一种膜外蛋白——CAMP因子，该因子具有促进溶血的作用，在与金黄色葡萄球菌分泌的β溶血毒素共同作用下，增强对羊血细胞的溶血程度和胞膜成分的溶解，即所谓的CAMP反应，目前无乳链球菌CAMP因子已成为鉴别无乳链球菌的重要指标。

王均等[15]针对无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列建立了无乳链球菌双重PCR的检测方法，该方法具有特异高的优点，但检测灵敏度要远低于巢式PCR。贾玉萍等[16]利用巢式PCR对牛源无乳链球菌进行检测，取得了较好的结果，但其选用的目标基因16S RNA对链球菌属的其他细菌可能会产生反应特异性影响。而且其检测模板是人工配制的含菌牛奶样品的DNA提取液，同本研究直接用血液相比，多了DNA提取的操作步骤，同时也未曾对患病奶牛进行检测。本研究选择无乳链球菌cfb基因为目标基因，首次建立了罗非鱼源的无乳链球菌巢式PCR检测方法，以血液为模板能直接检测出无乳链球菌含量大于8.7×104CFU/mL的血液样品，而常规PCR无论反应次数多高，都无法在此浓度下获得阳性结果。此方法使用血液进行采样和检测比较简便易行，除了应用于诊断鱼类无乳链球菌病外，还可用于监测和普查养殖生产中罗非鱼感染无乳链球菌的状况，可预见性提前做好预防，防止此病的发生。

灵敏度实验中，巢式PCR可以从1 μL的模板中检测出活菌浓度为8.7×100CFU/mL的无乳链球菌。在此浓度下，1 μL的模板中所含活菌数基本没有，理论上无法得到阳性结果。分析认为无乳链球菌在培养过程中有大量细胞死亡后并未降解，或者降解后DNA片段释放，使得反应体系中模板的DNA片段拷贝数远高于活菌数量，参与了PCR，使得实验灵敏度高于预期值。在使用罗非鱼血液样品进行巢式PCR时发现检测的灵敏度低于纯培养的细胞样品。这可能是因为血液中的复杂成分，如血细胞、血红素、血脂、金属离子等，对PCR的扩增效率造成了一定的影响[17]。此外，DNA聚合酶是PCR反应得以进行的最关键因素之一，不同来源的DNA聚合酶扩增效率不一样，会得到不同的检测灵敏度。因此，在使用本方法检测无乳链球菌时，若使用了不同品牌的DNA聚合酶、甚至同一品牌不同批次的聚合酶时，都需重新使用标准样品进行检测灵敏度的校对。

参考文献:

[1]Perera R P,Johnson S K,Collins M D,et al.Streptococcus iniae associated with mortality ofTilapianilotica×T.aureahybrids[J].J Aquat Anim Health,1994,6(4):335-340.

[2]Pasnik D J,Evans J J,Klesius P H.Duration of protective antibodies and correlation with survival in Nile tilapiaOreochromisniloticusfollowingStreptococcusagalactiaevaccination[J].Dis Aquat Organ,2005,66(2):129-134.

[3]谭晶晶,陈昌福,高宇,等.奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定、致病性及药物敏感性研究[J].华中农业大学学报,2010,29(6):745-751.

[4]黎炯,叶星,卢迈新,等.双重PCR快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2010,36(4):449-452.

[5]Eldar A,Bejerano Y,Bercovier H.StreptococcusshiloiandStreptococcusdifficile:two new streptococcal species causing a meningoencephalitis in fish[J].Curr Microbiol,1994,28(3):139-143.

[6]Evans J J,Klesiusph,Gilbert P M,et al.Characterization of β-haemolytic group BStreptococcusagalactiaein cultured seabream,SparusauratusL.,and wild mullet,Liza klunzingeri(Day),in Kuwait[J].J Fish Dis,2002,25(9):505-513.

[7]Salvador R,Muller E E,Freitas J C,et al.Isolation and characterization ofStreptococcusspp.group B in Nile tilapiaOreochromisniloticusreared in hapas nets and earth nurseries in the northern region of Parana State,Brazil[J].Cienc Rural,2005,35(6):1374-1378.

[8]李波,陈明,李莉萍,等.广西罗非鱼链球菌病病原的生化鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医,2008,35(10):93-95.

[9]张新艳,樊海平,钟全福,等.罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究[J].水产学报,2008,32(5):772-779.

[10]柯剑,赵飞,罗理,等.广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性[J].广东海洋大学学报,2010,30(3):22- 27.

[11]黄锦炉,汪开毓,肖丹,等.无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)三重PCR快速检测方法的建立与应用[J].海洋与湖沼,2012,43(2):254-261.

[12]饶静静,李寿崧,黄克和,等.致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立[J].中国水产科学,2007,14(5):749-755.

[13]王远微,汤承,于学辉,等.三重PCR检测鱼类致病性嗜水气单胞菌[J].微生物学报,2008,47(8):947- 951.

[14]祝璟琳,王国良,金珊.养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用[J].中国水产科学,2009,16(2):156-164.

[15]王均,汪开毓,肖丹,等.罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41(5):496-502.

[16]贾玉萍,周东顺,万仁忠,等.巢式PCR检测无乳链球菌16S rRNA方法的建立及应用[J].农业生物技术学报,2005,13(11):668-671.

[17]沈克峰,杨默,江千里.血液和骨髓标本中常见PCR反应抑制物的探究与分析[J].中国实验血液学杂志,2014,22(3):842-846.

(责任编辑：邓薇)

Development of nested PCR for detection of Streptococcus agalactiae from tilapia

SHAO Chen1,2,3,YI Yi1,2,3,LI Ya1,2,3,HUANG He1,2,3,WU Shi-hua1,2,3,YANG Jun4

(1.CollegeofBiologicalandChemicalEngineering,GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545006，Guangxi，China;2.GuangxiKeyLaboratoryofGreenProcessingofSugarResources，GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545006，Guangxi，China;3.KeyLaboratoryforProcessingofSugarResourcesofGuangxiHigherEducationInstitutes,GuangxiUniversityofScienceandTechnology,Liuzhou545006，Guangxi，China;4.LiuzhouFisheryTechnicalExtensionStation,Liuzhou545006,Guangxi,China)

Abstract：Based on the cfb gene sequence of Streptococcus agalactiae,two pairs of primers were designed and synthesized and the amplification conditions were optimized to establish the nested PCR method which could identify S.agalactiae with high sensitively.The results showed that S.agalactiae could be directly detected from blood sample at a minimum concentration as 8.7×104 CFU/ml by this method.Nineteen clinical S.agalactiae-infected tilapia samples collected from Guangxi province were applied to verify this method.The results showed that 260 bp fragment could be amplified in 18 samples and the sequencing analysis revealed that all the amplified fragment were cfb gene of S.agalactiae. The detection accuracy of this method was 94.7%.

Key words：nested PCR; Streptococcus agalactiae;cfb gene;tilapia (Oreochromis mossambicus)

中图分类号：S941.42

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)02-0040-05

作者简介：第一邵辰(1988-)，男，硕士研究生，主要从事水产致病菌的研究。通讯作者：杨军。E-mail:yangjun_yyz@163.com

收稿日期：2014-11-12；

修订日期：2015-06-17

资助项目：现代农业产业技术体系专项资金“国家罗非鱼产业技术体系”(CARS-49)；柳州市科学研究与技术开发计划课题(2013E020602)