MTMR14基因缺失促进小鼠成肌细胞增殖和分化

于孟飞，杨　潇，沈金花

(中南民族大学 生命科学学院，医学生物研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)



MTMR14基因缺失促进小鼠成肌细胞增殖和分化

于孟飞，杨潇，沈金花*

(中南民族大学 生命科学学院，医学生物研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

摘要为研究磷酸肌醇磷酸酶肌管相关蛋白14(MTMR14)在骨骼肌发生中的作用，通过组织切片和细胞培养技术研究了MTMR14敲除对骨骼肌的组织结构、成肌细胞分化和增殖的影响.结果表明：MTMR14敲除小鼠的腓肠肌和比目鱼肌的结构较同窝野生型小鼠产生了明显变化，MTMR14敲除小鼠的成肌细胞的分化和增殖成肌小管过程较野生型显著加快. MTMR14基因敲除后小鼠肌管细胞中平均细胞核数显著增加.故MTMR14基因缺失/敲除导致骨骼肌组织结构异常，干扰了骨骼肌肌肉发生过程中的成肌细胞的增殖和分化.

关键词成肌细胞；肌管相关蛋白14；增殖；分化；骨骼肌发生

Deficiency ofMTMR14 Promoted the Proliferation and Differentiation of Mouse Myoblasts

YuMengfei,YangXiao,ShenJinhua*

(Institute for Medical Biology & Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China, College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan, 430074, China)

AbstractTo investigate the role of myotubularin related protein 14 (MTMR14), a novel phosphoinositide phosphatase, in regulating myogenesis, the effects ofMTMR14 depletion on the structure, myoblast differentiation and proliferation were evaluated using tissue biopsy and cell culture techniques. The results demonstrated that the structures of both gastrocnemius and soleus muscles inMTMR14-depleted mice were different from their wild type (WT) littermates. Compared to the WT control, the myoblast ofMTMR14-depleted mice showed accelerated proliferation and differentiation into myotubes in culture. The depletion ofMTMR14 also induced an increase of the number of nuclei in myotubes. In conclusion, the deficiency/depletion ofMTMR14 led to the abnormal structure of skeletal muscles, and disrupted the proliferation and differentiation of myoblasts during skeletal myogenesis.

Keywordsmyoblast; MTMR14; differentiation; proliferation; skeletal myogenesis

骨骼肌在许多生理活动中发挥重要作用，如运动的发起、能量动态平衡和全身的代谢.机体衰老和疾病也与骨骼肌组织结构和/或功能异常相关[1, 2].骨骼肌肌肉的正确形成(也称肌肉发生)是一个受到精细调控的复杂过程，如成肌细胞周期的退出、肌肉细胞特异性蛋白的表达、细胞变形和融合成肌管细胞等多个环节[3, 4].肌管相关蛋白14(MTMR14)是一种肌肉特异性肌醇磷酸酶，MTMR14基因突变在多个物种中会引起肌肉疾病，如人、小鼠和斑马鱼等[5].本课题前期发现MTMR14基因敲除小鼠骨骼肌更易疲劳[6].最近研究发现MTMR14表达量随年龄增长而下降，MTMR14蛋白的流失通过影响Ca2+平衡而加速骨骼肌的衰老进程[7]. 所以MTMR14在骨骼肌肌肉形成过程中发挥重要调控作用.

多个单核成肌细胞融合成为多核的肌管细胞是骨骼肌肌肉发生过程中的关键环节[8].成肌细胞的融合不仅发生在动物机体发育过程中，也发生在成年个体中.因为肌管细胞中细胞核的积累对骨骼肌的生长和再生过程是一个必要条件.延时成像和电镜观察体外培养的成肌细胞发现：成肌细胞的融合是一个高度有序的连续过程，它涉及细胞之间的相互识别、粘附、对齐、细胞膜融合和形态变化等一系列细胞特异性事件[9]. 成肌细胞早期分化受到干扰或增强均能影响骨骼肌肌管细胞的形成和生长.故肌管细胞形成或生长发生改变是由于成肌细胞早期分化或融合过程改变所致.

本课题最新研究发现：小鼠MTMR14基因缺失能引起胚胎成纤维细胞自噬和增殖增强[10]. 故MTMR14基因的缺失或敲除对成肌细胞的增殖/融合和/或它们早期分化过程的影响成为本研究的关注焦点.本研究分别建立了源于野生型和MTMR14基因敲除小鼠的胚胎成肌细胞系，并分别比较了这两株细胞系的增殖速度、融合比率和单个肌管细胞中细胞核的平均数，结果表明：MTMR14缺失小鼠来源的胚胎成肌细胞较野生型生长速度更快，MTMR14基因缺失还加速了成肌细胞的分化.

1材料与方法

1.1材料和仪器

MTMR14杂合小鼠由美国凯斯西储大学瞿成奎教授提供.MTMR14基因敲除小鼠的繁殖、饲喂和基因型鉴定均参照文献[6].所有动物分笼饲养于控温、控湿的动物房中，采用12 h间隔性光照制度(8:00 AM～8:00 PM光照)，自由采食、饮水，动物实验均符合中南民族大学动物福利和使用委员会的相关要求和规定.苏木精-伊红(北京索莱宝)，多聚甲醛、Abam(Sigma,美国)，Han′s F10培养液(Biowest,法国)，DMEM、二抗、胰酶、胎牛血清(Gibco,美国)，eMyHC抗体(DSHB,美国)，成纤维生长因子(Peprotech,美国).

切片机(RM2235,德国Leica)，显微镜(LSM710,德国蔡氏)，CO2培养箱(INC108,德国Memmert)，生物安全柜(HR40-IIA2,中国海尔).

1.2病理分析

野生型和MTMR14敲除小鼠的腓肠肌和比目鱼肌分别以横向和纵向作10 μm切片，并用苏木精-伊红染色[11].染色后的切片经封片后，用数码相机拍照并用NIS-Elements Ar 3.0软件进行分析.通过分析骨骼肌中部区域的3个不同部位面积来确定骨骼肌横截面积(CSAs)，并以150根肌纤维的CSAs平均值来代表腓肠肌/比目鱼肌的数值.

1.3小鼠胚胎成肌细胞的分离和培养

采用酶消化法培养小鼠胚胎成肌细胞[12].将发育至5～7 d的小鼠胚胎的四肢骨骼肌用剪刀分离，在37℃含有1.5 IU /mL胶原蛋白酶、2.4 IU /mL中性蛋白酶和2.5 mM CaCl2的酶消化液中消化30 min，1000 r/min离心5 min后，用含有20%胎牛血清，2.5 ng/mL基础成纤维生长因子和1% ABAM的Han′s F-10培养液重悬细胞，再放入37.5℃，5% CO2培养箱中培养.

1.4成肌细胞增殖

成肌细胞在体外培养24，48 h后，采用MTT法进行活细胞计数[13]. 先将成肌细胞以3×104/mL接种到96孔板中，每孔100 μL，在完全培养基下培养5 d. 24 , 48 h后，用含有10 μL重组MTT的DMEM代替完全培养基.培养2 h后，用含有100 μL MTT溶解液的DMEM换液.在570 nm波长下检测细胞吸光度.用连接24，48 h细胞吸光度直线的斜率来表示成肌细胞增殖率.为确保成肌细胞的纯度，野生型和MTMR14敲除小鼠来源的成肌细胞MTMR14基因mRNA表达经PCR检测合格后，再进行MTT检测.

1.5免疫荧光

胚胎肌球蛋白重链蛋白基因簇(eMyHC+)是人和小鼠非常保守的骨骼肌发育分化的标记分子[14].表达通过改良的免疫荧光法进行eMyHC+的分化的成肌细胞计数[15].培养的成肌细胞经含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液室温固定后，用含有0.25% Triton X-100室温通透细胞膜10 min.再用含有1%牛血清白蛋白和0.1% Tween-20的磷酸缓冲液进行封闭再用1︰200抗eMyHC抗体在4℃下过夜杂交，用1︰1000的抗兔的FITC标记的二抗37℃杂交2 h，用DAPI染细胞核，用激光共聚焦显微镜检测相应的荧光强度.

1.6成肌细胞分化

为了诱导成肌细胞分化，在细胞汇合度达到80%时，细胞培养液换成含2%马血清和1% ABAM的DMEM.为了使肌管和细胞核可视，先用4%多聚甲醛固定正在分化的成肌细胞10 min，再在室温条件下用吉姆萨染色.由NIH ImageJ软件分析统计细胞核总数和肌管内细胞核总数.分化指数=采用胚胎肌球蛋白重链蛋白基因阳性细胞数/全部成肌细胞核数量×100%.当成肌细胞内具有2个以上的细胞核时，则为肌管细胞.融合指数=肌管细胞中细胞核数/全部成肌细胞核数.每个肌管细胞平均细胞核数=所有肌管细胞核数/肌管细胞数.

1.7数据统计

2结果

2.1MTMR14基因缺失导致腓肠肌细胞核数增加

前期研究发现MTMR14缺失能破坏肌肉细胞内Ca2+动态平衡引起重症肌无力.为检验MTMR14基因缺失能否引起骨骼肌结构改变，分别对野生型和MTMR14敲除小鼠腓肠肌进行纵横切片.如图1所示，MTMR14敲除小鼠腓肠肌纤维横截面积同野生型小鼠之间无显著差异.但MTMR14敲除小鼠腓肠肌细胞核数较野生型小鼠显著性增加(p<0.05)，说明MTMR14基因在骨骼肌形成中发挥调控作用.

WT:野生型; KO:敲除型;a) 野生型横切; b) 敲除型横切; c) 野生型纵切;d) 敲除型纵切;e) 腓肠肌横切截面积(n=5); f) 每个腓肠肌肌管细胞平均细胞核数(n=10);*p< 0.05图1　MTMR14敲除对小鼠腓肠肌的影响Fig.1　Effects of MTMR14 deletion on mouse extensor digitorum longus muscles

2.2MTMR14基因缺失导致比目鱼肌细胞核数增加

为了进一步确认MTMR14基因在骨骼肌形成过程中的调控作用，检测了MTMR14基因敲除对另一种骨骼肌，比目鱼肌的影响.如图2中比目鱼肌横切所示，MTMR14缺失小鼠比目鱼肌较同窝野生型小鼠之间显著增加(p<0.05).同时，MTMR14基因缺失小鼠比目鱼肌细胞核数较野生型小鼠也显著增加(p<0.05).这些结果同上面提到的腓肠肌中的结果相类似.这些结果进一步证明MTMR14在肌肉发生过程中发挥了重要作用.

WT: 野生型; KO: 敲除型a) 野生型横切; b) 敲除型横切; c) 野生型纵切; d) 敲除型纵切;e) 腓肠肌横切截面积(n=5); f) 每个腓肠肌肌管细胞平均细胞核数(n=10);*p< 0.05 图2　MTMR14敲除对小鼠比目鱼肌的影响Fig.2　Effects of MTMR14 deletion on mouse soleus muscles

2.3MTMR14基因缺失促进成肌细胞增殖

为进一步阐明MTMR14基因调控肌肉的机制，采用MTT法检测了MTMR14基因对成肌细胞增殖的影响，成肌细胞分别来源于野生型和MTMR14敲除小鼠胎鼠的骨骼肌(腓肠肌).如图3a所示，在MTMR14敲除小鼠中，MTMR14基因mRNA表达水平显著下降(p<0.05)，证明MTMR14基因被成功敲除.如图3b所示，成肌细胞体外培养24, 48 h后，MTMR14基因缺失均显著加快了成肌细胞的增殖速度.说明MTMR14在骨骼肌增殖中发挥重要调控作用.

WT:野生型; KO: 敲除型; n=4, *p< 0.05 图3　MTMR14敲除对小鼠成肌细胞中MTMR14 mRNA表达(a)和成肌细胞增殖(b)的影响Fig.3　Effects of MTMR14 deficiency on the expression of MTMR14 mRNA(a) and proliferation of mouse myoblasts (b)

2.4MTMR14基因缺失加快成肌细胞分化并破坏成肌细胞融合

由于成肌细胞能分化成肌管细胞，为深入探究MTMR14基因在肌肉发生过程中的作用，检测了MTMR14基因缺失对成肌细胞分化成肌管细胞的影响.如图4a所示，体外培养的成肌细胞被诱导分化成肌管细胞，肌管细胞在其胞质中表达绿色eMyHC蛋白.成肌细胞经诱导培养24 h后，MTMR14基因敲除组中分化的成肌细胞所占总细胞数的百分比显著高于野生型小鼠组(图4b,p<0.01).但成肌细胞经诱导培养48 h后，MTMR14基因敲除组和野生型组之间分化的肌管细胞占总细胞数百分比之间无显著差异(p> 0.05).说明MTMR14基因缺失能加快成肌细胞分化成为肌管细胞.

成肌细胞融合是骨骼肌形成过程中的一个重要过程，MTMR14基因敲除对成肌细胞融合过程的影响如图4c所示.成肌细胞经诱导分化24 h后，MTMR14缺失组中成肌细胞的融合率显著高于野生型组(p<0.01).但成肌细胞经诱导分化48 h后，敲除组与对照组之间的成肌细胞融合率无显著差异(p>0.05).与此相似，MTMR14基因缺失亦导致肌管细胞中细胞核平均数显著高于野生型(图4d，p<0.05)，说明MTMR14基因缺失能引起肌管细胞中细胞核平均数异常和融合过程加快.

WT: 野生型; KO: 敲除型; n = 4, *p< 0.05, **p< 0.01a) MTMR14缺失对小鼠成肌细胞分化的影响; b) MTMR14缺失对体外培养的小鼠成肌细胞分化的影响;c) MTMR14缺失对体外培养的小鼠成肌细胞融合的影响; d) MTMR14缺失对小鼠单个肌管细胞中细胞核数量的影响.图4　MTMR14缺失对小鼠成肌细胞分化成肌管细胞的影响Fig.4　Effects of MTMR14 deficiency on the differentiation of mouse myoblasts into myotubes

3讨论

本研究结果证实：MTMR14基因缺失不仅能引起骨骼肌(腓肠肌和比目鱼肌)结构异常，还能促进成肌细胞的增殖速度.同时，MTMR14基因缺失能加速成肌细胞向肌管细胞分化和肌管细胞平均细胞核数增加.这些结果表明MTMR14基因对骨骼肌形成具有重要调控作用.

MTMR14基因缺失可通过破坏骨骼肌细胞内Ca2+平衡导致肌肉耐疲劳度下降和恢复所需时间延长[6]. 为阐明其机制，我们首先采用组织切片对MTMR14敲除小鼠骨骼肌(腓肠肌和比目鱼肌)进行了分析.结果显示MTMR14基因敲除对两种骨骼肌的平均横截面积均无影响.但MTMR14敲除小鼠肌管细胞平均细胞核数较野生型显著增加.这些改变是导致MTMR14敲除小鼠易疲劳和肌肉耐力恢复慢的原因.提示MTMR14基因参与了骨骼肌的肌肉发生过程.

肌肉发生是一个受严格调控的复杂过程，它包含细胞周期的退出、生肌蛋白的表达、细胞粘附和融合成合胞体肌纤维等多个过程[16, 17].MTMR14敲除小鼠肌管形成和/或生长的改变是由成肌细胞早期的增殖和/或分化发生改变而引起的.MTMR14基因的缺失会加速成肌细胞的增殖速度，这些改变会导致成肌细胞增殖时间和/或成肌细胞融合成肌管细胞所需时间缩短，使成肌细胞提早退出细胞周期和未成熟肌管的形成.因此，加速的成肌细胞增殖、分化和缩短的融合成肌管等这三个事件解释了MTMR14基因缺失小鼠骨骼肌力量下降、肌肉恢复事件延长和易疲劳性[6]，以及其对锻炼引起的肌肉损伤更敏感的原因[7].

综上，MTMR14在成肌细胞分化和融合过程中发挥重要作用.MTMR14基因的缺失或敲除会破坏骨骼肌细胞的正常形成过程，并最终导致骨骼肌结构异常. 反之，结构异常的骨骼肌会导致动物机体骨骼肌在功能水平上的异常和/或下降. 然而，MTMR14基因缺失引起骨骼肌组织结构和功能异常的信号传导机制仍不清楚，亟待深入研究.

参考文献

[1]Jackman R W, Kandarian S C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 287(4): C834-43.

[2]Vinciguerra M,Musaro A,Rosenthal N. Regulation of muscle atrophy in aging and disease [J]. Adv Exp Med Biol,2010,694: 211-33.

[3]Ge Y,Waldemer R J,Nalluri R,et al. Flt3L is a novel regulator of skeletal myogenesis [J]. J Cell Sci,2013,126(Pt 15): 3370-3379.

[4]Jansen K M,Pavlath G K. Molecular control of mammalian myoblast fusion [J]. Methods Mol Biol,2008,475: 115-133.

[5]Dowling J J,Low S E,Busta A S,et al. Zebrafish MTMR14 is required for excitation-contraction coupling,developmental motor function and the regulation of autophagy [J]. Hum Mol Genet,2010,19(13): 2668-2681.

[6]Shen J,Yu W M,Brotto M,et al. Deficiency of MIP/MTMR14 phosphatase induces a muscle disorder by disrupting Ca2+homeostasis [J]. Nat Cell Biol,2009,11(6): 769-776.

[7]Romero-Suarez S,Shen J,Brotto L,et al. Muscle-specific inositide phosphatase (MIP/MTMR14) is reduced with age and its loss accelerates skeletal muscle aging process by altering calcium homeostasis [J]. Aging (Albany NY),2010,2(8): 504-513.

[8]Capers C R. Multinucleation of skeletal muscleinvitro[J]. J Biophys Biochem Cytol,1960,7: 559-566.

[9]Knudsen K A,Horwitz A F. Tandem events in myoblast fusion [J]. Dev Biol,1977,58(2): 328-338.

[10]Liu J,Lv Y,Liu Q H,et al. Deficiency of MTMR14 promotes autophagy and proliferation of mouse embryonic fibroblasts [J]. Mol Cell Biochem,2014,392(1/2): 31-37.

[11]Leeuwenburgh C,Gurley C M,Strotman B A,et al. Age-related differences in apoptosis with disuse atrophy in soleus muscle [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2005,288(5): R1288-R1296.

[12]Springer M L,Blau H M. High-efficiency retroviral infec-

tion of primary myoblasts [J]. Somat Cell Mol Genet,1997,23(3): 203-209.

[13]Ciavarra G,Zacksenhaus E. Rescue of myogenic defects in Rb-deficient cells by inhibition of autophagy or by hypoxia-induced glycolytic shift [J]. J Cell Biol,2010,191(2): 291-301.

[14]Weiss A,Mcdonough D,Wertman B,et al. Organization of human and mouse skeletal myosin heavy chain gene clusters is highly conserved [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(6): 2958-2963.

[15]Yan L,Jia Z,Cui J,et al. Beta-adrenergic signals regulate cardiac differentiation of mouse embryonic stem cells via mitogen-activated protein kinase pathways [J]. Dev Growth Differ,2011,53(6): 772-779.

[16]Bentzinger C F,Wang Y X,Rudnicki M A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol,2012. 4(2):a008342.

[17]Krauss R S. Regulation of promyogenic signal transduc-

tion by cell-cell contact and adhesion [J]. Exp Cell Res,2010,316(18): 3042-3049.

中图分类号Q253; Q28

文献标识码A

文章编号1672-4321(2016)01-0034-05

基金项目国家自然科学基金面上资助项目(81170227); 湖北省自然科学基金重点资助项目(2012FFA028)

作者简介于孟飞(1982-)，男，讲师，博士，研究方向：心律不齐，E-mail:65556248@qq.com

收稿日期2015-09-25*通讯作者沈金花(1975-)，女，教授，博士，研究方向：肌肉发生和相关疾病的机制，E-mail：shenjinhua2013@163.com