色谱纯化和质谱分析法研究牛骨源咸味肽

李迎楠++刘文营++张顺亮++成晓瑜

摘 要：以牛骨为研究对象，通过中空纤维超滤装置、Sephadex G-25凝胶色谱柱对相对分子质量小于5 000的酶解产物进行初步分离，选用制备型及分析型高效液相色谱分析仪对咸味肽进行纯化、收集及分析。结果表明：收集得到牛骨源咸味肽为单一组分；用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪对咸味肽进行分析，得到其为相对分子质量均小于1 000的短肽，其呈现咸味的物质质荷比值可能为679.510 9。

关键词：咸味肽；凝胶色谱；高效液相色谱；基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪

Separation， Purification and Analysis of Salty Peptides Derived from Bovine Bone by Chromatography and Mass Spectrometry

LI Yingnan， liu Wenying， ZHANG Shunliang， CHENG Xiaoyu*

（China Meat Processing and Engineering Center， China Meat Research Center， Beijing Academy of Food Sciences， Beijing 100068， China）

Abstract： The enzymatic hydrolysate of bovine bone with relative molecular weight < 5 000 was separated by hollow fiber ultrafiltration and Sephadex G-25 column chromatography. Two salty peptide fractions from the hydrolysate were purified by preparative high performance liquid chromatography （HPLC） and the pooled samples were analyzed by HPLC. The two fractions were found to consist of a single homogenous component. As analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）， both peptide fractions had a relative molecular weight less than 1000， the salty taste compound of which was m/z 679.510 9.

Key words： salty peptides； gel permeation chromatography； high performance liquid chromatography （HPLC）； matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF/MS）

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006

中图分类号：TS251.94 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2016）03-0025-04

引文格式：

李迎楠， 刘文营， 张顺亮， 等. 色谱纯化和质谱分析法研究牛骨源咸味肽[J]. 肉类研究， 2016， 30（3）： 25-28. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

LI Yingnan， LIU Wenying， ZHANG Shunliang， et al. Separation， purification and analysis of salty peptides derived from bovine bone by chromatography and mass spectrometry[J]. Meat Research， 2016， 30（3）： 25-28. （in Chinese with English abstract）DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.03.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

食盐是人类生存最重要的物质之一，也是烹饪中最常用的调味料，但是过多地摄入食盐不仅与高血压的发生有密切关系，也会对心、脑、肾等器官产生损害[1-2]。随着现代科技的发展，使得安全健康的食盐替代物的开发具有重要意义和前途[3]，咸味肽作为一种可呈现咸味的多肽，其来源于天然动植物，开发与应用前景广阔，具有重要的社会意义和经济价值。

近年来，国内外学者针对可呈现咸味的多肽开展了不少工作，Nakamura等[4]通过合成方法制备出无Na+存在的咸味肽，其具有能够在食品加工时替代食盐的潜力，但成本昂贵；Zhu Xiaolin等[5]在对无盐酱油研究过程中发现3 种具有咸味的二肽，且其中两种具有抑制血管紧张素转化酶活性的功能；张顺亮等[6]通过对比不同凝胶层析色谱分离得到咸味肽，结果显示，其制备的咸味肽的相对分子质量可能为849.38 D，但咸味肽分离纯化效果并不理想。目前超滤装置及制备型高效液相色谱仪被广泛应用于多种物质单体的制备，特别是制备型高效液相色谱仪具有分离效率高、产物纯度高、分离速度快等特点，是制备纯化天然产物的极好手段[7-8]。

本研究利用食品级生物酶试剂对粉碎后牛骨进行酶解，通过逐级纯化酶解液最终得到咸味肽，选用超滤膜过滤、Sephadex G-25凝胶色谱、制备型高效液相色谱仪对冻干后咸味组分进行纯化并收集，采用高效液相色谱仪对其进行纯度鉴定，并利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MOLDI-TOF/MS）对其成分进行分析，为咸味肽开发利用提供技术支持，尤其是为咸味肽应用于食品加工具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛骨 北京丰台牛街清真市场；复合动物蛋白酶、风味蛋白酶 诺维信（中国）投资有限公司；葡聚糖凝胶G-25 美国Pharmacia公司；甲醇（色谱纯） 美国Merck公司。

1.2 仪器与设备

强力破骨机 廊坊惠友机械有限公司；YXQGO2型电热式蒸汽消毒器 山东新华医疗器械；JJ-1精密定时电动搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；AL104电子天平 梅特勒-托利多国际股份有限公司；CL-25型蠕动泵中空纤维超滤膜组件 北京旭邦膜设备有限责任公司；SL-Ⅲ型数控层析冷柜 北京博翔兴旺科技有限公司；LGJ-30D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；Waters LC 2695-2998分析型液相色谱仪、Waters LC 2545-2998制备型液相色谱仪 沃特世科技（上海）有限公司；4700 MOLDI-TOF/MS质谱联用仪 美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 咸味肽粗提物制备

参考文献[6]方法并稍作修改。取新鲜牛骨，去肉、粉碎、除脂，取骨渣进行酶解，酶解温度为60 ℃，骨渣与水质量比为1∶1，添加复合动物蛋白酶15 mg/g（骨渣），酶解2 h；然后添加风味蛋白酶10 mg/g（骨渣），酶解4 h，酶解期间持续搅拌；将酶解液真空抽滤后，用截留相对分子质量为5 000的超滤膜过滤，收集滤液真空冷冻干燥，即为咸味肽粗提物，将咸味肽粗提物透析除盐后备用。

1.3.2 咸味肽凝胶柱色谱分离纯化

称取Sephadex G-25 30 g，加入300 mL超纯水，室温下过夜使其充分溶胀，除去多余的水及细小颗粒，反复洗涤2～3 次，真空抽滤除去气泡[9-10]，灌柱后用洗脱液平衡柱子，自动部分收集器收集时间为5 min。将分离得到的组分经多次收集后冻干，进行咸味感官评定。

Sephadex G-25凝胶色谱柱分离条件为：玻璃柱（60 cm×16 cm），进样量质量浓度50 mg/mL，进样量1 mL，流速为0.8 mL/min。洗脱液为超纯水，

λ为220 nm。

1.3.3 咸味肽制备型液相色谱分离及收集

将冻干后咸味肽制成溶液，经0.45 μm滤膜过滤后备用。制备型液相色谱分离条件为：色谱柱为C18柱（10型250 mm），采用超纯水-甲醇（95∶5～90∶10（V/V））为流动相进行梯度洗脱20 min，样品质量浓度50 mg/mL，进样量体积为1 mL，流速为5 mL/min，λ为220 nm，柱温25 ℃。

1.3.4 咸味肽分析型液相色谱纯度鉴定

将制备型液相色谱收集得到的咸味肽冻干后制得溶液，经0.45 μm滤膜过滤后备用。分析型液相色谱鉴定条件为：色谱柱为C18柱（4.6型250 mm），样品质量浓度1 mg/mL，进样量体积为10 μL，流速为1 mL/min，其余条件同1.3.3节。

1.3.5 咸味肽MALDI-TOF/MS分析

数据的采集：取0.5 μL样品点靶室温下自然风干后，将0.5 μL、5 mg/mL基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（溶于50%乙腈溶液）点在样品上自然风干。实验前需在设定的质量范围内用混合蛋白标准品进行质量校正，以保证获得数据误差小于5[11]。

质谱仪器参数：YAG激光器（355 nm）离子源，采用正离子反射模式检测，加速电压20.00 kV，扫描范围：600～3 000 m/z，质谱信号为2 000 次激光点累加所得[12-13]。

1.3.6 感官评定

咸味肽组分咸味判定：将收集得到的不同峰组分分别冻干，制成1 mg/mL溶液，作出感官评定，判断不同峰组分是否有咸味[14]。

2 结果与分析

2.1 咸味肽凝胶柱Sephadex G-25分离及咸味判定结果

凝胶柱Sephadex G-25的分离范围是1 000～5 000 D，且具有较好的脱盐作用[15]，将超滤后冻干样品进行凝胶层析色谱分离，由图1可知，超纯水为洗脱液可得到5 个色谱峰，峰之间距离适中，分离效果较好。其中组分Ⅳ的响应值最大，峰Ⅳ较窄且峰型较尖、高，但峰Ⅱ较宽，比较圆滑，峰型不太理想[16]，收集得到峰Ⅱ溶液颜色较深，考虑为样品中的杂质色素。凝胶层析色谱是根据被分离物质分子质量大小不同而进行分离，若相对分子质量较为接近，则单峰中可能含有多种物质，因此，需对得到的组分进行进一步分离。

将分离得到的5 种组分进行多次收集，冷冻干燥制成干品。分别对5 种组分进行感官评定，由表1可知，经过凝胶柱Sephadex G-25分离的组分中，组分Ⅳ有咸味，其他组分均无咸味。

2.2 咸味肽高效液相色谱纯化结果及纯度分析

制备型高效液相色谱图谱与咸味肽的纯度有直接关系，同时可通过不断改变洗脱梯度、样品浓度等使得峰型得到改善[17]。将凝胶柱Sephadex G-25分离得到组分Ⅳ配制成溶液，过滤后进行制备型高效液相色谱分析。由图2可知，该组分分离出多种物质，经多次进样收集洗脱液，冻干后经感官评定，可知呈现咸味的多肽集中于第2～3峰，其余峰组分冻干后无咸味，故在后续的收集中，着重收集前4个峰。多次实验发现，中间两个峰具有一定的关联，现有工艺条件未实现完全分离，且响应值较高，说明咸味肽在该组分中为主要物质。

将制备型高效液相收集得到的第2～3峰组分分别冻干后配制成溶液a和b，过滤后利用分析型高效液相色谱分别对其进行纯度分析[18]。由图3可知，二者均为单一峰，组分的保留时间分别为2.538 3 min和2.533 3 min，结合制备型高效液相色谱结果，可以推断出二者可能是一种物质的同分异构体。经归一化定量，其纯度均在98%以上，此时流动相甲醇的体积分数约为5.5%，实验得到的咸味肽具有较强的极性。

2.3 咸味肽MALDI-TOF/MS质谱分析结果

MALDI-TOF/MS在分析多肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐等物质。不同多肽在MALDI源离子化过程中离子化效率不同，相互之间存在竞争，因此可能存在一些多肽因离子化抑制而未被检测到，同时MALDI-TOF/MS质谱中检测到的峰也可能是一些肽段峰的加钾峰[19-20]。采用MALDI-TOF/MS对制备型HPLC收集到的第2组分进行质谱分析，其一级质谱结果见图4。分离纯化得到的咸味肽组分均为相对分子质量小于1 000的短肽，在质荷比（m/z）600～3 000之间，咸味肽中信号较强的母离子为612.849 4、622.047 0、679.510 9、701.497 4、792.601 8，结合咸味肽为该物质中的主要物质，初步判定咸味肽的质荷比值可能为679.510 9，但不排除所检测物质中含有其他可呈现咸味多肽的可能性。

3 结 论

凝胶柱Sephadex G-25可分离得到5 个色谱峰，其中组分Ⅳ的响应值最大，峰型较好，且经感官评定，组分Ⅳ有咸味，其他组分均无咸味；对组分Ⅳ进行制备型高效液相色谱分析，得到多种物质，其中呈现咸味的多肽集中于第2～3峰，且两个峰具有一定的关联；分别对其进行纯度分析，发现二者均为单一峰，保留时间分别为2.538 3 min和2.533 3 min，可以推断二者是一种物质的同分异构体，且该物质具有较强的极性。

采用MALDI-TOF/MS质谱分析，得到的咸味肽组分均为相对分子质量小于1 000的短肽，结合咸味肽为该物质中的主要物质，初步判定咸味肽的质荷比值可能为679.510 9。实验丰富了天然产物咸味肽的品类，为牛骨源咸味肽的开发提供了理论依据和技术支持。

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