非水相酶促合成萘普生油酸甘油酯前药*

姜佳雯，孙立瑞，李海艳，辛嘉英，，夏春谷

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程省重点试验室，黑龙江哈尔滨150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成和选择氧化国家重点试验室，甘肃兰州730000）



非水相酶促合成萘普生油酸甘油酯前药*

姜佳雯1，孙立瑞1，李海艳1，辛嘉英1，2，夏春谷2

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程省重点试验室，黑龙江哈尔滨150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成和选择氧化国家重点试验室，甘肃兰州730000）

摘要：在非相有机试剂异辛烷中通过固定化脂肪酶Novozym435催化萘普生甲酯与三油酸甘油酯反应，通过薄层层析色谱与高效液相色谱对反应液进行分析，并考察了底物摩尔比、反应时间、反应温度、酶添加量、溶剂添加量对转化率的影响。结果表明，当三油酸甘油酯与萘普生甲酯摩尔比3.85，反应时间144h，反应温度50℃，酶添加量150mg，溶剂添加量5mL时，转化率最高达到65.91%。

关键词：萘普生油酸甘油酯；脂肪酶；非水相

萘普生（Naproxen），化学名为2-（6-甲氧基-2-萘基）-2-丙酸，是最常用的非甾体抗炎药（NSAIDs）2-芳基丙酸类手性药物之一，它的α位含有一个手性碳原子，有光学异构体一对。经过临床研究表明（S）-（+）-型萘普生的活性明显优于（R）-（-）-构型萘普生。萘普生为一种非选择性的COX抑制剂，通过抑制前列腺素在人体内细胞和组织中的合成来抑制疼痛，实现抗炎、解热、镇痛的作用。萘普生是全球最常用的解热镇痛药和最畅销的非处方药之一[1]。临床上常被用于减轻或控制由炎症所引起的症状和病征，如生理期腹痛、人工流产术后抗炎、急性慢性附件炎、盆腔炎所致的腰腹部疼痛、骨关节或软组织的疼痛、类风湿性关节炎等有非常显著的疗效。

由于萘普生属于脂溶性弱酸性药物，在水中几乎不溶，在吸收过程中解离出的大量H+会对胃肠道粘膜一些严重的不良反应，其中以胃肠道反应最为常见，表现为：胃、十二指肠糜烂、溃疡，甚至出血、穿孔。长期以来，萘普生对胃肠道的刺激性和副作用、溶解性差、半衰期短等缺点限制了其在临床上的应用[2]。为了提高萘普生的可用性和生物相容性，必须降低其副作用、延长药物的作用时间。

前体药物是指将具有生物活性的药物分子原型通过与前体基团接合形成具有生物活性的衍生物[3]，前体药物可以在体内经过代谢可逆转变为生物活性药物，所以前体药物又被称做生物可逆性药物前体药物，最早是由澳大利亚国立大学的Albert提出。十九世纪时，前药就己经被用于临床实验，近些年来，应用前体药物的理论修饰有缺点、不良反应的生物活性药物，并提高原药药效方而取得了很好的效果。

利用萘普生化学结构中的羧基基团进行结构改造制备成前体药物，不仅降低药物解离造成的胃肠道粘膜刺激，还可以利用三油酸甘油酯的特性增加药物可利用度，改善萘普生的脂溶性或水溶性[4]。萘普生前药应在胃肠道环境中保持稳定状态，在血浆或靶细胞中易水解，从而有效避免胃肠道刺激。

因此，本文通过脂肪酶在非水相体系中催化萘普生甲酯与三油酸甘油酯发生转酯反应，合成萘普生油酸甘油酯前药。三油酸甘油酯可降低胃溃疡指数，增强胃的防御因子[5]。三油酸甘油酯可以促进胃内前列腺素PGE2的合成和保护性粘液的分泌而起到保护胃粘膜的作用[6]。并且三油酸甘油酯具有延长药物释放时间的作用[7]。

1　实验部分

1.1主要试剂及仪器

萘普生（Naproxen，质量分数＞99%北京精华耀霸医药科技有限公司）；三油酸甘油酯（Triolein（TO）量分数＞98%国药集团化学试剂有限公司）；异辛烷（Iso-Octane质量分数＞99.0%天津天力化学试剂有限公司）；固定化Novozym435脂肪酶（10000PLU/g丹麦Novozymes公司）。

RV10型旋转蒸发仪（德国IKA仪器公司）；HZQ-D型恒温振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；Thermo Fisher UltiMate 3000型超快速液相色谱仪（美国赛默飞世尔公司）；TGL-16G型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；GF254硅胶层析板（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2萘普生甲酯的合成

将5.5g萘普生添加到圆底烧瓶中用100mL甲醇40mL苯将萘普生完全溶解[8]，加入浓H2SO45mL作为催化剂，在反应瓶口冷凝回流管一端加装分水器，加热回流4～5h反应停止冷却后，移入分液漏斗中，先用蒸馏水洗涤，再用5%的NaHCO3水溶液进行洗涤。将上层有机相降压蒸干溶剂，加入含少量甲醇的石油醚重结晶得白色结晶转化率100%。

1.3萘普生三油酸甘油酯的合成

在25mL瓶中加入一定量的三油酸甘油酯、萘普生甲酯、异辛烷（经过分子筛除水）和脂肪酶，空气浴振荡（180r·min-1）进行转酯反应，待反应进行完全转化率不再提高后经离心去除反应体系中的酶与分子筛，旋转蒸发去除反应溶剂。

1.4萘普生油酸甘油酯的薄层色谱的定性分析

萘普生甲酯与三油酸甘油酯通过脂肪酶N435催化进行转酯反应一定时间。将反应后所得到的混合物经过高速离心后除去脂肪酶得到反应液，吸取10μL反应液进行点样，展开剂为V（正己烷）∶V（乙醚）∶V（醋酸）=85∶15∶1[9 ]；检测波长254nm；展开方法:上行法；展开距离:16cm。

1.5 HPLC色谱分析

采用高效液相色谱（Thermo Fisher UltiMate 3000型液相色谱仪）进行转化率分析。定时吸取10μL样品用甲醇稀释至100倍体积，然后用有机相滤头（13mm.45μm尼龙，上海安谱科学仪器有限公司）进行过滤，上样量为10μL，色谱柱选用Agilent液相XDB-C18反相色谱柱（5μm，150× 4.6mm，美国安捷伦公司）。流动相：85%甲醇，15%蒸馏水；流速为1mL·min-1；紫外检测波长选取325nm。产物萘普生油酸甘油酯的峰面积占总峰面积的百分数即代表萘普生油酸甘油酯的转化率[10]。

2　结果与讨论

2.1底物萘普生甲酯与三油酸甘油酯摩尔比的影响

虽然本文萘普生甲酯与三油酸甘油酯转酯反应后三油酸甘油酯不必去除，但过量的三油酸甘油酯可以引起萘普生甲酯的酰基供应不足，将导致萘普生通过转酯反应转化为萘普生三油酸甘油酯的转酯反应转化率降低。为了最大化转酯反应转化率，探究最适底物摩尔比，对转酯反应底物摩尔比进行了探究。固定反应体系中萘普生甲酯量为0.5mmol，取三油酸甘油酯添加量0.125～1.75mmol范围。研究结果见图1。

图1　底物摩尔比对转化率的影响Fig.1　Effect of the ratio of naproxen methyl ester to triolein on the conversion of transesterification product

当n（SN）∶n（TO）=4∶1或2∶1时，产物转化率随着三油酸甘油酯用量的变化趋势为随三油酸甘油酯添加量增加而增加，因为三油酸甘油酯量为此范围反应的制约因素，增加其用量使反应转化率提高。当n（SN）∶n（TO）=1∶1时，产物的转化率达到最大值（50.43%），但随着三油酸甘油酯添加量持续增大，产物转化率变化趋势改变，这可能是因为三油酸甘油酯添加量过量，三油酸甘油酯由反应制约因素变为过量。与此同时，萘普生甲酯添加量相对不足，相当于在反应过程中反应体系中没有足够的酰基供体，反应速度下降，转化率降低。因此，在后续实验中，采用n（SN）∶n（TO）=1∶1。

2.2转酯反应时间的影响

转酯反应的转化率随反应时间变化趋势见图2。

图2　反应时间对转化率的影响Fig.2　Effect of time on the conversion of transesterification product

由图2可以看出，转酯反应的转化率随着反应时间的增长而变大，在144h达到最大值（51.13%），继续增加反应的时间转化率基本保持稳定不变。因此，本文后续的实验中设定反应时间为144h。

2.3转酯反应温度的影响

转酯反应的反应温度对N435催化萘普生甲酯与三油酸甘油酯的转酯反应影响见图3。

图3　反应温度对转化率的影响Fig.3　Effect of temperature on the conversion of transesterification product

一定范围内，随着反应温度升高，转酯反应转化率不断提高，这是因为增加反应温度可以使反应体系黏度降低，外扩散阻力减小，这有利于底物与酶接触，反应速率加快，转化率提高。当温度达到50℃时，转化率达到最大值（53.47%）。如果反应温度继续升高，产物的转化率迅速降低，从而使萘普生三油酸甘油酯的转化率迅速降低。在本文后续实验中采用50℃为反应温度。适当提高反应温度，可提高酶活性，有助于反应向正反应方向进行；另一方面，过高反应温度会影响酶稳定性使反应整体的转化率降低。

2.4脂肪酶Novozym435的添加量的影响

酶催化反应中酶用量对反应的转化率也有影响：（1）酶用量不足，不能很好地发挥催化作用，反应转化率低：（2）过量添加酶会使反应体系传质阻力增大，也造成不必要的经济浪费。因此，不论从提高转化率角度还是从经济节约角度来考虑，确定酶最佳添加量很有必要。

脂肪酶N435催化萘普生甲酯发生转酯反应合成萘普生油酸甘油酯，催化剂脂肪酶添加量对转酯反应转化率的影响趋势见图4。

图4　酶的添加量对转化率的影响Fig.4　Effect of enzyme loading on the conversion of transesterification product

当脂肪酶添加量采用125mg，产物转化率达到最优值（58.70%）。低于125mg，转酯反应的转化率随着酶的添加量的增加而提高，说明此时酶添加量不足;添加量高于125mg，转酯反应转化率随着脂肪酶添加量增大而减小。所以在本文接下来实验中参考最佳脂肪酶添加量为125mg。

2.5非水相溶剂异辛烷添加量的影响

图5　溶剂添加量对转化率的影响Fig.5　Effect of isooctane loading on the conversion of transesterification product

由于三油酸甘油酯的性质，黏度较大，在无溶剂体系中脂肪酶的扩散、萘普生甲酯的溶解均效果不佳。通过添加适量非水相体系溶剂的可以降低反应体系黏度、改善酶的扩散性、使底物与酶的接触面扩大。当溶剂添加量多于10mL时，继续增加溶剂添加量反而使酶表面底浓度减小从而降低了反应的转化率。因此本文选取10mL作为溶剂添加量。

3　响应曲面优化

在单因素试验结果的基础上，以转化率为响应值（Y），以底物摩尔比（A）、酶添加量（B）、溶剂添加量（C）为自变量，设计3因素3水平共17个试验点的响应面分析试验来优化脂肪酶催化合成萘普生油酸甘油酯的反应条件。

利用Design-expert 8.0.5b软件建立回归方程，得到转化率对底物摩尔比（A）、酶添加量（B）和溶剂添加量（C）的二次回归模型方程为：Y=+0.094901+ 0.16574A+2.21686×10-3B-7.34158×10-3C+8.13440 ×10-4AB-1.86667×10-3AC+1.03200×10-5BC-0.03 6176A2-1.24755×10-5B2+2.27425×10-4C2。

根据回归分析方程在考察的区域内绘制响应面图，底物摩尔比、酶添加量和溶剂添加量3因素对转化率的交互作用见图6～8。

图6　底物摩尔比和酶添加量的交互作用Fig. Response surface and contour showing the effects of the ratio of naproxen methyl ester to triolein and enzyme loading on yield of the conversion of transesterification product

图7　酶添加量和溶剂添加量的交互作用Fig.7　Response surface and contour showing the effects of enzyme loading and isooctane loading on yield of the conversion of transesterification product

图8　底物摩尔比和溶剂添加量的交互作用Fig.8　Response surface and contour showing the effects of the ratio of naproxen methyl ester to triolein and isooctane loading on yield of the conversion of transesterification product

可以看出3个因素与Y呈抛物线关系，随着各因素值的增加，Y呈现不同程度的上升趋势。当各因素达到一定值后，继续增加各因素值，Y呈现下降趋势。说明转酯反应的转化率与底物摩尔比、酶添加量和溶剂添加量之间并非线性关系，只有在最适的条件底物摩尔比3.85，酶添加量150mg溶剂添加量5mL下脂肪催化合成萘普生油酸甘油酯的转化率达到最高0.6591。

4　结论

本文优化了脂肪酶Novozym435在非水相试剂异辛烷中催化萘普生甲酯与三油酸甘油酯发生转酯反应制备萘普生油酸甘油酯的合成。合成的最佳

条件为:n（SN）∶n（TO）=3.85，反应时间为144h，反应温度为50℃，酶用量为150mg，溶剂异辛烷添加量为5mL。在最佳条件下，用萘普生甲酯作底物在常压下反应144h达到最大的转化率65.91%。由此可见，利用萘普生甲酯为底物制备萘普生三油酸甘油酯的方法具有转化率高，条件温和，产物无需纯化的特点，有利于实际生产应用。

参考文献

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Synthesis of a new type prodrug for naproxen-oleylglycerol by lipase-catalyzed transesterification of naproxen and triolein

JIANG Jia-wen1，SUN Li-rui1，LI Hai-yan1，XIN Jia-ying1，2，XIA Chun-gu2
（1.Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2.Key Laboratory of Carbonyl Synthesis and Selective Oxidation, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China）

Abstract：The synthesis of a new type prodrug for naproxen-oleylglycerol through the lipase-catalyzed transesterification of naproxen and triolein was studied. The reaction was indentified by TLC and HPLC and the influential factors of substrate molar ratio,reaction time,reaction temperature,enzyme amount and isooctane amount were systematically investigated.Results indicated that in the reaction system the optimal conditions as follows n(（SN）):n(（TO）)=3.85,reaction time 144h reaction temperature 50℃,enzyme amount 150mg and 5mL Isooctane added.Under the optimal conditions the maximum yield was obtained as high as 65.91%.

Key words：naproxen-oleylglycerol；lipase；nonaqueousphase

通讯作者：辛嘉英（1966-），男，博士，哈尔滨商业大学食品工程学院，龙江学者特聘教授，博士生导师。

作者简介：姜佳雯（1989-），女，在读硕士研究生，哈尔滨商业大学农产品加工及贮藏专业。

基金项目：黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（GC13C111）；2-芳基丙酸类药物的酶法手性拆分。

收稿日期：2015-12-15

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160312

中图分类号：O643.32

文献标识码：A