参益安神片改善小鼠学习记忆的作用及其机制

宋　媛　蔡广知　姜丽娇　张雪萍　张宇翔　王莎莎　庞宇涵　贡济宇

(长春中医药大学，吉林　长春　130117)



参益安神片改善小鼠学习记忆的作用及其机制

宋媛蔡广知姜丽娇张雪萍张宇翔王莎莎庞宇涵贡济宇

(长春中医药大学，吉林长春130117)

〔摘要〕目的探讨复方制剂参益安神片改善记忆作用的药效学及其作用机制。方法采用水迷宫试验、避暗实验、跳台实验观察空白对照组、阳性对照组、复方制剂参益安神片高(1.607 g/kg)、中(0.536 g/kg)、低(0.269 g/kg)剂量组对小鼠改善记忆的作用；采用荧光法对小鼠脑内5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)进行含量测定，初步研究复方制剂参益安神片改善小鼠记忆的作用机制。结果避暗试验中剂量组、高剂量组小鼠的潜伏期明显延长(P<0.05)，错误次数、进入暗室的动物数也明显减少(P<0.05)；水迷宫试验高剂量、中剂量组小鼠2 min内到终点的动物明显增加(P<0.05)；跳台试验潜伏期有明显延长作用(P<0.05)；脑5-HT、DA、NE含量与空白组比较显著增加。结论复方制剂参益安神片具有明显改善记忆的功能,其机制可能与5-HT、DA、NE的相互调节有关。

〔关键词〕参益安神片；学习记忆；5-羟色胺；多巴胺；去甲肾上腺素

参益安神片是在参芪五味子片〔1〕的基础上，结合文献报道〔2，3〕按照中医理论设计而成的处方，由人参、五味子、酸枣仁、益智四种中药材组成。人参和益智仁为益智安神的常用药，酸枣仁具有养心安神、敛汗的功效，它不仅是治疗失眠不寐之药，还能滋补强壮，久服能养心健脑；加用五味子，有酸敛收涩、益气生津等功效，善治心肾两经的虚亏或不调引起的心神不安、惊悸失眠等。但复方制剂是否具有明显的改善记忆、镇静催眠的作用未见报道。本文主要对复方制剂参益安神片改善记忆作用进行药效学研究，并探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1实验药品及试剂复方制剂参益安神片，自制。含生药量2 g/片(所需药材均购于长春市宏检大药房)；枣东安神颗粒(北京优你特药业有限公司)批号：130501；实验所需药物均以蒸馏水配制所需浓度。酸性正丁醇、正庚烷、邻苯二甲醛-盐酸溶液、碘试液、半胱氨酸溶液、pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)试液。

1.2动物健康昆明鼠种(KM)，18～22 g，雌雄各半，购于吉太小动物用品经销处：受试小鼠引进后置于长春中医药大学动物实验室饲养。温度：(20±3)℃,相对湿度：50%～70%。

1.3实验仪器AL 204万分之一天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；CaryEclipse分子荧光光度计(郑州中谱仪器设备有限公司)R205恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；T18 basic组织匀浆仪(广州仪科实验室技术有限公司)；KQ3200DB数控超声清洗器(广州仪科实验室技术有限公司)；YLS3T型跳台仪(广州仪科实验室技术有限公司);BA-200小鼠避暗仪(广州仪科实验室技术有限公司);Morris水迷宫实验系统(北京中科院生理所)。

1.4方法将50只小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组、高剂量组(1.606 5 g/kg)、中剂量组(0.535 5 g/kg)、低剂量组(0.267 8 g/kg)，3个剂量组分别灌胃给药参益安神片，空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组给予枣东安神颗粒，灌胃15 d后，开始对各组小鼠进行训练并测定。

1.4.1跳台试验〔4〕分别将小鼠放在绝缘平台上(计时开始)。记录第2次跳下平台的潜伏期、3 min内的跳下平台的错误次数和各组跳下平台的动物数。训练3 d后开始测试。

1.4.2避暗实验将小鼠置于电击室，背对洞口，先给予条件刺激(灯光)15 s，在亮灯10 s后开始通电5 s(电击强度为40 V、50 Hz)。记录每只小鼠进入暗室的潜伏期、5 min内进入暗室错误的次数和各组进入暗室的动物数。并计算5 min内进入暗室(错误反应)的百分率，训练5 d后开始测试。

1.4.3水迷宫实验从训练第1天开始，每批实验各有1只小鼠给药,平行操作,5 min后再给第二批小鼠注射,以此类推。每天训练4次,每次随机选择一个入水点,观察并记录小鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间(潜伏期)。4次训练小鼠分别从4个不同的入水点入水，如果小鼠在120 s内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期计为120 s，每次训练间隔60 s，以4次的平均时间及路程作为每天的训练成绩，连续训练5 d后开始测定。

1.4.4复方制剂参益安神片片对小鼠脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的影响〔5，6〕

1.4.4.1脑组织NE含量测定上述实验小鼠50只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，取左半脑组织加入2 ml酸性正丁醇后匀浆，2 500 r/min离心5 min，分别取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超声1 min，2 500 r/min离心5 min分别取底层水相。水相50 μl,加PBS 150 μl加EDTA 40 μl,加新配制的碘液20 μl，混匀，静置3 min，分别加碱性磷酸钠40 μl，混匀，静置3 min，分别加醋酸40 μl，混匀，80℃水浴10 min，冷却即得。吸取各样品200 μl置96孔板内，进行含量测定，激发波长382/488。

1.4.4.2脑组织中DA的含量测定上述实验小鼠50只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，去左半脑组织加入2 ml酸性正丁醇后匀浆，分别取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超声1 min，2 500 r/min离心5 min分别取底层水相。水相50 μl,加PBS 150 μl加EDTA 40 μl,加新配制的碘液20 μl，混匀，静置3 min，分别加碱性磷酸钠40 μl，混匀，静置3 min，分别加5 mol/L醋酸40 μl，混匀，100℃水浴15 min，冷却即得。精密吸取各样品200 μl置96孔板内，进行含量测定，激发波长为325/385。记录结果。

1.4.4.3脑组织中5-HT的含量测定上述实验小鼠50只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，去左半脑组织加入2 ml酸性正丁醇后匀浆，分别取上清液0.4 ml,加正庚烷0.8 ml，加0.1 mol/L的HCl 0.2 ml超声1 min，2 500 r/min离心5 min分别取底层水相。取水相0.4 ml，加入0.25%半胱氨酸(新配)0.1 ml，再加入0.002%OPT-10 NHCl 3 ml。混匀，沸水浴10 min，冷却即得。精密吸取各样品200 μl置96孔板内，进行含量测定，激发波长为368/480。

1.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1复方制剂参益安神片跳台实验结果阳性对照组、中剂量组潜伏期与错误次数与空白对照组比较显著差异(P<0.05或P<0.01)，高剂量组潜伏期与错误次数与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。见表1。

表1　复方制剂参益安神片对小鼠跳台实验及避暗实验的影响±s,n=10)

与空白对照组比较：1)P<0.05；2)P<0.01；下表同

2.2复方制剂参益安神片避暗实验结果中剂量组错误次数与空白对照组比较有显著差异(P<0.05)，高剂量组、阳性对照组错误次数与空白对照组比较有极显著性差异(P<0.01)，其他4组测试潜伏期与空白对照组比较均有增长。见表1。

2.3复方制剂参益安神片水迷宫实验结果中剂量组、高剂量组实验完成时间〔(69.84±23.37)s、(65.45±22.98)s〕与空白对照组〔(114.82±7.96)s〕比较差异显著(P<0.05)。阳性对照组为(101.72±26.32)s，低剂量组为(80.50±27.65)s。

2.4小鼠脑内单胺类神经递质测定结果见表2。高、中剂量

表2　复方制剂对小鼠脑内单胺类神经

组脑内5-HT、DA、NE含量与空白对照组比较显著增加(P<0.05)，低剂量组与空白对照组比较均升高，但无显著差异(P>0.05)。

3讨论

参益安神片选取了四味常用的中药进行配伍，通过避暗试验、跳台试验、水迷宫试验可以看出无论是错误次数还是潜伏期给药组都有所改善，其药效与阳性对照药对比药效相当，因而从药效学角度看来，参益安神片的改善学习记忆作用可以得到较充分的肯定，有较好的益智作用。

单胺类神经递质包括儿茶胺和吲哚胺两类，前者包括DA、NE和肾上腺素，后者为5-HT，大脑皮质、纹状体中存在大量的DA和5-HT能神经末梢，他们对高级活动如感情、学习、记忆起重要作用。DA含量下降是脑功能衰老的表现之一，学习记忆增强常伴有NE、DA的增加，但对5-HT的报道还不是特别明确。参益安神片片改善小鼠学习记忆能力可能与5-HT、DA、NE的相互调节有关。相关文献报道〔7〕，神经中枢内的DA代谢会影响NE的代谢,NE可能调节广泛脑区的突触传入活动，增大环境中有意义的信息传入，而抑制其他传入刺激的干扰，从而提高注意力，增强学习能力。

本实验采用荧光法对神经递质的含量进行测定用于研究改善记忆的作用机制，荧光法与液相色谱法进行比较，荧光法实验能提高实验效率，目前试剂盒的应用也越来越广泛,可以在后续的机制研究试验中进行优选。

4参考文献

1祝洪艳,何忠梅,王国丽,等.参芪五味子片对神经系统的药理作用及临床研究〔J〕.吉林中医药,2014;34(8):842-4.

2李廷利,于爽,辛静.刺人参的有效部位改善睡眠作用及作用机制的研究〔J〕.中药药理与临床,2012;28(5):105-8.

3蒋益萍,张巧艳,张宏,等.正交试验优选五味子木脂素类成分的提取工艺〔J〕.中成药,2013;35(11):2390-4.

4杜正彩,邓家刚.复方绞股蓝益智颗粒改善记忆作用药效学研究〔J〕.中国实验方剂学杂志,2012;18(15):250-3.

5周桂媛.当归有效成分抗早老性痴呆药理作用及分子机制〔J〕.实用中医内科杂志,2013;27(2):122-3.

6魏小娟,许建华.荧光-反相高效液相色谱法同时测定小鼠脑组织中3种单胺类神经递质〔J〕.海峡药学,2010;22(4):61-3.

7杜晖.运动对去甲肾上腺素的影响及去甲肾上腺素在记忆中的作用〔J〕.科技信息(学术研究),2007;(36):243-5.

〔2015-07-26修回〕

(编辑袁左鸣)

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1587-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.022

通讯作者：贡济宇(1960-)，女，硕士生导师，教授，主要从事药物分析学研究。

基金项目：吉林省医药产业发展专项资金计划(No.20130727020YY)

第一作者：宋媛(1989-)，女，硕士，主要从事中药分析学研究。