不同炮制方法对土家药“江边一碗水”化学成分的影响

邓旭坤，高康丽，陈旅翼，蒋　捷，蔡　爽，林亲雄，关祥会，马玉雪

(中南民族大学 药学院，武汉430074)



不同炮制方法对土家药“江边一碗水”化学成分的影响

邓旭坤，高康丽，陈旅翼，蒋捷，蔡爽，林亲雄，关祥会，马玉雪

(中南民族大学 药学院，武汉430074)

摘要为研究“江边一碗水”在炮制前后其化学成分和含量的变化规律，揭示醋炙法和醋蒸法的炮制机理.采用紫外光谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法等检测了“江边一碗水”生品及其炮制品中的主要化学成分.结果表明：经炮制后，其醋炙品和醋蒸品中的主要化学成分的溶出率与生品相比均有不同程度的增加，其中槲皮素、鬼臼毒素、山奈酚等成分的含量增加显著，且醋蒸后鬼臼毒素可少量转化为苦鬼臼毒素.该研究可为“江边一碗水“炮制质量控制标准的制订及其相关研究提供一定的理论和物质基础.

关键词土家药；江边一碗水；醋炙法；醋蒸法；化学成分；鬼臼毒素

Effects of Different Preparation Methods on the Contents of Chemical Components in Tujia MedicineDiphylleiasinesis

DengXukun,GaoKangli,ChenLüyi,JiangJie,CaiShuang,LinQinxiong,GuanXianghui,MaYuxue

(College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China)

Abstract To investigate the variation of the chemical compositions and content ofDiphylleiasinesisbefore and after processing, and uncover the processing mechanism of vinegar-stir-baked and vinegar-steamed method, the main chemical compositions in crude and processedDiphylleiasinesiswere determined by UV,TLC and HPLC. The results indicated that the dissolution rate of the main chemical components in vinegar-stir-baked and vinegar-steamed product especially qucertin, kaempferol and podophyllotoxin significantly increased compared with crude product. After vinegar-steamed, a small amount of the podophyllotoxin converted into picropodophyllotoxin. This research provided theoretical and materials basis for formulating of quality control standard for the processingDiphylleiasinesisand the related research.

KeywordsTujia medicine;Diphylleiasinesis; vinegar stir-baked method; vinegar-steamed method; chemical component; podophyllotoxin

“江边一碗水”为小檗科植物南方山荷叶(DiphylleiasinensisH.L.li. )的根及根茎[1]，是我国武陵山区土家族常用的民族药材，具有活血化瘀、抗炎止痛等作用，土家医临床上习惯将之用于治疗跌打损伤、风湿性关节炎等病症[2]. 由于“江边一碗水”具有较强的毒副作用，土家族民间常用醋蒸法、醋炙法、醋磨法、姜制法、童便浸泡法等炮制方法对其进行减毒增效.

民族药中的化学成分是其药效及毒性作用的物质基础，本课题组以鬼臼毒素含量和水浸出量为评价标准，初步认定醋蒸法和醋炙法是较为理想的炮制方法，并对其最佳炮制工艺分别进行了优选[3,4].本文通过比较“江边一碗水”在炮制前后其化学成分及含量的变化规律，揭示了“江边一碗水”醋炙法和醋蒸法的炮制机理，可为制定“江边一碗水”及其醋炙品和醋蒸品的饮片质量标准提供实验依据.

1仪器与材料

1.1仪器

高效液相色谱仪(Ultimate 3000 型, 美国戴安公司)，旋转蒸发仪(RE 52-98 型, 上海亚荣生化仪器厂)，电子天平(CP214型, 奥豪斯仪器上海有限公司)，电磁炉(C16-221型, 广东康宝电器有限公司)，超纯水制备仪(ASWO-0005-M型, 重庆颐洋企业发展有限公司)，紫外可见分光光度计(Lambda-35, 美国珀金埃尔默公司)，三用紫外线分析仪(ZF-6型, 上海嘉鹏科技有限公司).

1.2材料

“江边一碗水”产于湖北神农架林区(中南民族大学药学院万定荣教授鉴定本品为小檗科山荷叶属的草本植物南方山荷叶的根茎)，鬼臼毒素对照品(批号23301, 中国药品检定所)，薄层层析板(GF254高层薄层板, 青岛海洋化工厂)，色谱甲醇(Tedia Company)，氯仿、甲醇(国药集团化学试剂有限公司)，米醋(批号20140126, 海天调味食品股份有限公司)，超纯水.

1.3色谱条件

色谱柱(TC-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm, Agilent Technologies Inc)，流动相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(42.5︰57.5, V/V)，检测波长为 290 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃.

2方法与结果

2.1炮制品制备

醋炙品：将生品切薄片，用米醋(每100 g药材加30 mL)闷润2 h后，150 ℃下炒制4 min，干燥，粉碎，备用.

醋蒸品：将生品切薄片，用米醋(每100 g药材加30 mL)闷润1 h后，置于锅内隔水常压蒸制2 h，干燥，粉碎，备用.

2.2生品和炮制品的紫外吸收光谱(UV)的比较

供试品溶液的制备：分别精密称取生品、醋炙品、醋蒸品粉末(过40目筛) 0.2 g，置于圆底烧瓶中加入CHCl350 mL，加热回流1 h，冷却抽滤，所得滤液用旋转蒸发仪蒸干，加适量甲醇超声溶解，定容至50 mL容量瓶，滤过，滤液即为供试品溶液.

紫外扫描：分别对生品及其炮制品的供试品溶液进行紫外光谱的扫描.扫描波长范围为700 ～ 200 nm，结果见图1. 由图1可知，“江边一碗水”的生品及其炮制品在紫外光谱图中的吸收峰基本一致，无明显差别，说明炮制前后药材的化学成分种类未发生显著改变.

图1　 “江边一碗水”生品、醋炙品、醋蒸品的紫外扫描对比图 Fig.1　UV spectrums comparison diagram of crude product, vinegar stir-baked product and vinegar-steamed product

2.3生品和炮制品的薄层色谱(TLC)的比较

供试品溶液的制备：分别取“江边一碗水”生品及其炮制品粉末各0.2 g，置圆底烧瓶中加入CHCl350 mL，加热回流1 h，冷却抽滤，所得滤液用旋转蒸发仪蒸干，加适量甲醇超声溶解，滤过，即得供试品溶液.

对照品溶液的制备：取鬼臼毒素对照品，加甲醇制成每1 mL 含 0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液.

薄层色谱实验条件：硅胶板，展开剂系统：二氯甲烷-甲醇(20︰1,V/V)，分别在可见光，254 nm和365 nm波长处进行观察，测定结果如图2所示.由TLC图对比可知：生品与炮制品的化学成分的种类未见明显差异，但醋炙品，醋蒸品中的一些化学成分的含量较生品相比有所增加.

每块薄层板从左向右依次为：鬼臼毒素标准品，生品，醋炙品，醋蒸品a) 可见光; b) 波长254 nm; c) 波长365 nm图2　不同吸收波长下薄层色谱(TLC)对比图Fig.2　TLC comparison diagram under different absorption wavelength

2.4生品和炮制品的高效液相色谱(HPLC)的比较

供试品溶液的制备：分别精密称取生品、醋炙品、醋蒸品粉末(过40目筛)0.2 g，置于圆底烧瓶中加入CHCl350 mL，加热回流1 h，冷却抽滤，所得滤液用旋转蒸发仪蒸干，加10 mL甲醇超声溶解，过0.45 μm 微孔滤膜后，得供试品溶液，备用.每次进样10 μL，在上述色谱条件下进行检测，结果见图3和表1.

根据液相色谱图对生品及醋炙品的特征峰进行对比分析，由表1可知: 1,3,4,5,6,8,9号峰面积均有所增加，2,7号峰面积下降并产生10号新物质，其中目前本课题组已确定的峰分别为：2(苦鬼臼毒素葡萄糖苷)，3(苦鬼臼毒素)，4(槲皮素)，5(鬼臼毒素)，6(3-O-甲基槲皮素)，8(山萘酚).经醋炙后2号峰(苦鬼臼毒素葡萄糖苷)含量减少了40.5%，含量增加较明显的有：4号峰(槲皮素)增加了37.2%，5号峰(鬼臼毒素)增加了22.4%，8号峰(山萘酚)增加了128.5%.

对生品及醋蒸品的特征峰进行对比分析，经醋蒸后1,3,4,5,6,8,9号峰，峰面积均有所增加，9号峰增加明显，2,7号峰面积下降，其中2号峰(苦鬼臼毒素葡萄糖苷)含量减少了42.4%，增加较明显的有：4号峰(槲皮素)增加了30.1%，5号峰(鬼臼毒素)增加了13.9%，6号峰(3-0-甲基槲皮素)增加了34.3%，8号峰(山萘酚)增加了82.6%，除此之外，产生了10号新物质.

2) 苦鬼臼毒素葡萄糖苷；3) 苦鬼臼毒素；4) 槲皮素；5) 鬼臼毒素；6) 3-O-甲基槲皮素；8)山奈酚 a) 生品-醋炙品；b)生品-醋蒸品图3　生品、醋炙品、醋蒸品HPLC图谱镜像比较图Fig.3　The HPLC comparison diagram of crude product, vinegar stir-baked product and vinegar steamed product

编号生品醋炙醋蒸变化情况生品-醋炙生品-醋蒸醋炙-醋蒸120.19725.24224.008+5.045+3.811+1.234216.1739.6119.322-6.562-6.851+0.28931.1491.2261.265+0.077+0.116-0.03941.9492.6742.536+0.725+0.587+0.138590.352110.560102.944+20.212+12.592+7.62064.0785.8815.789+1.803+1.711+0.09278.1728.1205.373-0.052-2.799+2.747810.97325.07220.034+14.099+9.061+5.03891.1154.0298.107+2.914+6.992-4.07810 00.5061.185+0.506+1.185-0.679

从“江边一碗水”生品、醋炙品和醋蒸品的对比可知，经炮制后，炮制品中的鬼臼毒素含量均高于生品，但醋蒸品中臼毒素含量较醋炙品降低，是由于蒸制时受热时间较长，鬼臼毒素含量下降.故将鬼臼毒素标准品长时间高温加热处理后，制备成供试品溶液进行HPLC检测，结果见图4. 图4中1号峰(鬼臼毒素)长时间高温加热后，会少量转化为2号峰，这是醋蒸品鬼臼毒素含量低于醋炙品的原因，图4c中鬼臼毒素经过长时间加热后所生成的2号峰即为苦鬼臼毒素.

1) 鬼臼毒素；2)苦鬼臼毒素图4　高温加热后鬼臼毒素标准品(a)，鬼臼毒素标准品(b)，苦鬼臼毒素标准品(c)的HPLC图Fig.4　The HPLC diagram of podophyllotoxin standards after heated(a), picropodophyllotoxin standards(b) and podophyllotoxin standards(c).

此外，由于炮制过程中加入了辅料醋，会引进一些米醋中含有的成分，对辅料醋进行了HPLC分析，所得结果见图5.由图5可知：炮制辅料醋的化学成分出峰时间较靠前，炮制之后9号峰增加明显(醋炙后增加了261.3%，醋蒸后增加了627.1%)，分析可能是辅料醋带入的物质.

图5　炮制辅料醋的HPLC图谱Fig.5　The HPLC diagram of vinegar

3讨论

中药和民族药物炮制后常能减毒或增效，这种作用的发挥主要建立在改变药材中化学成分的基础之上. 传统上土家医对“江边一碗水”采取醋蒸法和醋炙法两种炮制方法，本文深入研究了这两种不同炮制方法对其药材中化学成分的种类和含量的影响.

对比分析药材炮制前后的UV图谱，TLC图谱和HPLC图谱变化，发现“江边一碗水”经过醋蒸或醋炙后，总煎出率明显提高，其中化学成分种类变化不大，但一些相关化学成分的含量变化较大，由HPLC图谱可知：炮制后产生了一个微量的新物质(10号峰).药材经醋炙或醋蒸炮制后主要化学成分含量增加，是由于经醋润泡后药材质地松软，植物细胞壁在酸性条件下遭到破坏，醋蒸或醋炙使其高温受热后，随着细胞壁和细胞膜的破坏，其水溶性和脂溶性成分的溶出率均显著增加.醋蒸品中鬼臼毒素较醋炙品含量略低是由于长时间高温加热，使其转化为苦鬼臼毒素所致；醋蒸与醋炙炮制后药材中苦鬼臼毒素葡萄糖苷含量明显降低，是由于炮制过程中苦鬼臼毒素葡萄糖苷在酸性受热条件下水解转化为其他物质所致.此外，两种炮制品的9号峰较生品均显著增加，可能是加入辅料醋后带入的物质.对于炮制辅料醋是否会引起药材中化学成分的改变尚有待进一步探讨，以期深入阐释其炮制机理.

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中图分类号R282.71

文献标识码A

文章编号1672-4321(2016)01-0055-04

基金项目国家科技部“十二五”科技支撑计划资助项目(2012BAI27B06)；国家自然科学基金资助项目(81073147)

作者简介邓旭坤(1972-)，男，教授，博士，研究方向：药理学，中药炮制学，E-mail：dxk711208@163.com

收稿日期2015-09-15