响应面法优化当归总黄酮提取工艺研究

蔡璇（肇庆出入境检验检疫局，广东肇庆526060）



响应面法优化当归总黄酮提取工艺研究

蔡璇
（肇庆出入境检验检疫局，广东肇庆526060）

摘要：以乙醇-水为提取剂，总黄酮提取量为考察指标，通过醇提取法提取当归中的总黄酮成分。通过单因素试验分别考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度对总黄酮提取量的影响，在此基础上利用Design-Expert软件Box-Behnken中心组合设计法设计响应面分析料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度4个因素对总黄酮提取量的影响，并通过方差分析回归建立数学模型。料液比1∶11（g/mL），乙醇体积分数70 %，提取时间2.5 h，提取温度60℃，在此条件下，总黄酮提取量达到0.0228mg/g。结果表明：Box-Behnken设计结合响应面分析法可以很好地对当归总黄酮提取工艺进行优化。

关键词：当归；黄酮；提取；响应面法

当归是伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，其化学成分主要有黄酮类、苯酚类、香豆素类、有机酸类、氨基酸类及多糖类等。当归的一类重要活性物质就是黄酮类化合物，具有抑制NO生成、抗氧化和抑菌杀菌等作用[1-3]。

本文根据醇提取法，采用单因素试验分别考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度对总黄酮提取量的影响，对当归中总黄酮的提取与含量测定进行初步研究，同时选择响应面法优化其最适提取方法的工艺条件，旨为进一步开发和利用当归总黄酮提供理论参考。

1　材料与仪器

1.1材料

当归（甘肃产）：购于肇庆大参林药店，粉碎后备用。

1.2仪器与试剂

UV/VIS 916型分光光度计：澳大利亚GBC；FY135中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；SB25-120超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-S2系列恒温水浴锅：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；DHG-907013数显电热恒温干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；RE-5299旋转蒸发器：巩义市予华仪器有限责任公司。

芦丁对照品：中国药品生物制品检定所提供，批号：100080-200707；其它试剂均为分析纯；试验用水为双蒸水。

1.3方法

1.3.1当归中类黄酮物质的提取与样品溶液的制备

准确称取当归2 g置于100 mL圆底烧瓶中，以一定的料液比加入乙醇-水溶液进行回流提取，共进行3次提取后，合并3次提取液，过滤后收集滤液为样品溶液。

1.3.2标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品10.00 mg置于50 mL量瓶中，加60 %乙醇水溶液溶解，定容即得。

精密移取上述标准品溶液0.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6 mL分别置于10 mL容量瓶中，各加入60%乙醇溶液至5mL，加入5%的亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，放置6 min，加入10 %硝酸铝溶液0.3 mL，再放置6 min，加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液4.0 mL，加蒸馏水定容至刻度。于分光光度计上在λ= 508.73 nm处测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，黄酮含量ρ为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3当归总黄酮含量的测定

准确吸取样品溶液适量，按照芦丁标准曲线制作方法测定吸光度，根据回归方程计算质量浓度（C），再根据质量浓度计算出当归中黄酮的提取量[8]。

当归总黄酮提取量/（mg/g）=样品中总黄酮含量（mg）×乙醇体积（mL）/样液体积（mL）×称取药材粉末质量（g）

1.3.4当归总黄酮提取条件的优化方法

选取料液比、乙醇体积分数、提取时间、温度4个可能影响提取效果的因素做单因素试验，以确定相关因素对当归提取物中总黄酮含量的影响，为响应面试验提供各因素的取值范围，利用响应面的试验结果确定当归总黄酮的最佳提取条件。

1.3.5当归总黄酮提取响应面法优化分析

本试验采用Design-Expert 7软件中的Box-Behnken设计原理设计响应面试验。根据单因素试验结果，选取料液比、乙醇体积分数、提取时间和提取温度4个因素作为试验因素，以黄酮提取量为响应值设计试验。试验因素及水平见表1。

2　结果与讨论

2.1标准曲线的制作及回归方程

以芦丁标准溶液的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，见图1。

表1当归Box-Behnken的中心组合因素水平表Table 1 The level of the central composition of Angelica sinensis Box-Behnken

图1芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

并进行线性回归，得回归方程A=11.994ρ+0.029 8，其中A为吸光度，ρ为芦丁溶液浓度；r2=0.999 9，结果显示，芦丁在0.024 g/L～0.052 g/L内具有良好的线性关系。

2.2单因素试验结果

2.2.1料液比对总黄酮提取量的影响

料液比对总黄酮提取量的影响见图2。

图2料液比对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of material liquid ratio on total flavonoids extraction

从图2可知，在一定范围内，药材的黄酮提取量随料液比的增大而呈上升趋势，但料液比增大到一定程度后，黄酮提取量逐渐趋于饱和。当归在料液比为1∶13（g/mL）时总黄酮提取量达到最大，故料液比选择1∶11、1∶13、1∶15（g/mL）进行响应面法优化。

2.2.2乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响见图3。

图3乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoids extraction

由图3可知，药材的总黄酮提取量随着乙醇体积分数的增大而逐渐增大，当达到一定峰值时，黄酮的提取量反而下降。这种现象可能是由于脂溶性杂质增多，与黄酮类化合物竞争和乙醇结合，从而导致黄酮类化合物提取率下降。当乙醇体积分数为60 %时总黄酮提取量达到峰值，故选择50 %、60 %和70 %进行响应面法优化。

2.2.3提取时间对总黄酮提取量的影响

提取时间对总黄酮提取量的影响见图4。

图4提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time fraction on total flavonoids extraction

由图4可以看出，药材的黄酮提取量在一定范围内，随提取时间的延长而有所增大，但当延长到一定时间后黄酮的提取量反而下降，可能是由于提取时间过长，黄酮物质被破坏，导致提取量下降。从图可知，提取时间为2 h时，总黄酮提取量达到最大，故选择1.5、2 h和2.5 h进行响应面法优化。

2.2.4提取温度对总黄酮提取量的影响

提取温度对总黄酮提取量的影响见图5。

图5提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of temperature on total flavonoids extraction

由图5可以看出，药材的黄酮提取量随温度的提高而有所上升，但当温度到达一定时，黄酮的提取量会有所下降，可能是温度过高，黄酮物质的稳定性受到一定影响，且杂质的溶出量也会增加，导致提取量下降。当提取温度为50℃时，总黄酮提取量达到最大，故选择40、50℃和60℃进行响应面法优化。

2.3当归总黄酮水浴法提取条件的优化

2.3.1数学模型的建立

本试验Box-Behnken中心组合设计的试验方案和结果见表2，其中1～24为析因试验，24～29为中心试验。

表2当归Box-Behnken中心组合设计方案及结果Table 2 The central composite design scheme and results of Angelica sinensis Box-Behnken

采用响应面分析法分析试验结果，得以总黄酮提取量为响应值的回归方程为：

y/（mg/g）=0.016-7.908×10-4A+8.484×10-4B+4.267× 10-4C+1.732×10-3D-1.087×10-3AB-4.72×10-4AC+6.495× 10-4AD-1.223×10-3BC+4.139×10-4BD+2.651×10-3CD+ 2.297×10-4A2-3.321×10-4B2+1.921×10-3C2-7.648×10-4D2

式中：y为总黄酮提取量，A为料液比，B为乙醇体积分数，C为提取时间，D为提取温度。

2.3.2单因素试验结果数学模拟

运用软件对表2中的29个响应值进行回归分析，得到方差分析表，见表3。

表3当归黄酮提取回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Angelica sinensis

从表3可知，以总黄酮提取量为响应值时，模型P 为0.479 2>0.05，表明该二次方程模型不显著，失拟项F值为0.006 0<0.01，回归模型不能较好的描述各因素与响应值之间的真实关系。各因素及其交互因素、二次项的P值均大于0.05，表明4个提取因素在进行总黄酮提取量优选时没有优选到最佳条件，需进一步进行优化。

2.3.3响应面法优化当归总黄酮水浴法提取条件

采用Design-Expert 7软件分析当归提取总黄酮中各因素两两交互作用对总黄酮提取率影响绘制响应曲面图，见图6，得到从当归中提取总黄酮的最佳工艺条件为料液比1∶11（g/mL），乙醇体积分数70 %，提取时间2.5 h，提取温度60℃。

图6当归各因素两两交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface map of the effect of the interaction between the two two elements and the extraction rate of total flavonoids

2.4验证试验

在响应面优化后的最佳条件下，即当归在料液比1∶11（g/mL），乙醇体积分数70 %，提取时间2.5 h，提取温度60℃条件下，进行3次平行试验，总黄酮平均提取量达到0.021 7 mg/g，RSD为2.21 %，模型对其总黄酮提取量的预测值为0.022 8 mg/g，真实值与预测值的误差为-4.94 %。

4　结论

通过单因素试验分别考察料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对当归总黄酮提取量的影响，在此基础上，采用Design-Expert软件的Box-Behnken中心组合设计方法设计响应面试验，建立数学模型，得到了较优的提取工艺条件，并结合响应面分析得到的数学模型，预测更优的工艺条件，在进行验证试验后，得到总黄酮最佳提取工艺条件。

参考文献：

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Angelica Sinensis by Response Surface Method

CAI Xuan
（Zhaoqing Entry-exit Inspection and Quarantine，Zhaoqing 526060，Guangdong，China）

Abstract：Using ethanol- water as extracting agent，total flavonoids extraction amount as the indexes，through the ethanol extraction method to extract from Angelica sinensis total flavonoids. The effects of ethanol volume fraction，ratio of material to liquid，extraction time and extraction temperature were investigated by single factor experiment. The Design-Expert software Box-Behnken center combination design method was used to design response surface analysis. The statistical analysis and mathematical modeling were also applied for analysis the data. The results showed that the optimal extraction parameters would be the material liquid ratio of 1∶11（g/mL），ethanol volume fraction of 70 %，extraction time of 2.5 h，and extraction temperature of 60℃. Under these conditions，totalflavonoidsextractionamount reached 0.022 8 mg/g. Box-Behnken design combined with response surfaceanalysismethod can be used to optimize the extraction processof total flavonoidsfrom Angelica sinensis.

Key words：Angelica sinensis；flavonoids；extraction；response surface method

作者简介：蔡璇（1979—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：商品理化分析。

基金项目：广东省肇庆市科技创新计划项目（2014G110）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.026