富硒黄豆中可溶性硒蛋白的提取工艺

李宝瑞，陈彦卓，韩杰，高俣，张安宁，铁梅，*（.辽宁大学环境学院，辽宁沈阳0036；.辽宁碧海环境保护工程监理有限公司，辽宁沈阳008）



富硒黄豆中可溶性硒蛋白的提取工艺

李宝瑞1，陈彦卓2，韩杰1，高俣1，张安宁1，铁梅1，*
（1.辽宁大学环境学院，辽宁沈阳110036；2.辽宁碧海环境保护工程监理有限公司，辽宁沈阳110081）

摘要：选择pH=7.2的磷酸缓冲液为浸提剂从富硒黄豆中提取可溶性硒蛋白，研究了液料比、提取温度、提取时间对黄豆蛋白提取率的影响。在单因素试验的基础上，根据Box-Benhnen的中心组合试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法确定了富硒黄豆中硒蛋白提取的最佳工艺：液料比11∶1（mL/g）；提取温度44℃；提取时间96 min；在此条件下，可溶性硒蛋白的提取率可达到76.03%。进一步研究表明：富硒黄豆中不仅含有硒蛋白，而且还含有大量的其他有机硒化合物。

关键词：富硒黄豆；硒蛋白；提取工艺

硒（Se）是人和动物的必需微量营养元素，具有重要的生理功能，大量资料证实或提示，硒具有广泛的生物学作用，在预防克山病、某些癌症和延缓衰老中发挥着重要作用[1-3]。我国2/3的地区缺硒，大量研究表明有机硒，尤其是蛋白硒毒性小、生物利用率高，因此如何获取具有生物活性的硒蛋白，已成为人们研究的热点[4-10]。我国是世界上种植黄豆的主要国家，黄豆具有很高的营养价值，蛋白质含量在豆类中居前列，黄豆也成为了富硒效果较好的农产品[11]。

目前，国内外分离提取黄豆蛋白仍以碱提酸沉为主，但强碱容易引起赖氨酸损失，产生一些有害物质，如赖氨酰胺丙氨酸，还可能造成蛋白质的变性和水解，从而影响其生物活性、营养价值和商业价值[12-14]。因此本研究选取磷酸盐缓冲溶液为浸提剂，探究富硒黄豆中可溶性硒蛋白提取效果的影响因素，对进一步研究硒蛋白的结构和功能性因子有着重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

富硒黄豆：种植时土壤施硒浓度分别为0、10、20、40 mg/kg；硒标准液（1 000 mg/L）：国家环保总局标准样品研究所；硝酸、过氧化氢、硝酸镍均为优级纯：国药集团化学试剂有限公司；试验用水均为超纯水。

1.2仪器与设备

Spectr AA 220型原子吸收光谱仪、cary50UV-Vis分光光度计：美国Varian公司；GTA110型石墨炉、MDS-2002A型压力自控密闭微波消解系统：上海新仪微波化学科技有限公司；KJELTEC2100型半自动凯式定氮仪：瑞典富斯-特卡托公司；超纯水机：美国Millipore公司；XZ-21K高速冷冻离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司、HH-8数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司。

1.3方法

1.3.1样品处理

黄豆样品采收后，先用大量自来水冲洗，再以超纯水洗涤3次，沥干，装入塑料袋中，置于-85℃冷冻冰柜冷冻24 h后，再移至真空冷冻干燥系统中，在真空度3.5 Pa，温度为-55℃条件下进行连续72 h冷冻干燥。粉碎干燥好的样品，装入塑料自封袋中，置干燥器中保存备用。

1.3.2黄豆样品中总硒的测定

称取0.5 g黄豆粉末于聚四氟乙烯消化罐中，加入5 mL HNO3和1 mL H2O2，拧紧外盖放入微波消化仪，微波消解程序为：第一工步：1 min、0.5 MPa；第二工步：2 min、1.0 MPa；第三工步：3 min、1.5 MPa；消解完成后，在可调试电热板上加热赶酸30 min，自然冷却后用超纯水定容至50 mL容量瓶中待测。将硒标准溶液逐级稀释成硒标准工作母液（250 μg/L），利用自动进样器软件稀释系统将其配成50、100、150、200、250 μg/L浓度绘制标准工作曲线。硒的吸收峰面积（A）与硒浓度（μg/L）在0～250 μg/L范围内呈线性关系，线性方程为A=0.003 1C+0.014 6（r=0.994 2），检出限为1.20 μg/L。石墨炉原子吸收光谱仪工作条件及升温程序见表1。

表1石墨炉升温程序Table 1 Temperature rising process of graphite furnace

1.3.3黄豆中蛋白的提取

取3 g富硒黄豆样品，按一定的液料比加入浸提液，在一定温度和时间下振荡，25℃下4 000 r/min离心30 min，取上清液在冰浴下缓慢加入4倍溶液体积丙酮于-20℃冰箱放置4 h后，4℃下10 000 r/min离心20 min，弃上清液并在通风橱吹干丙酮，所得固体即为可溶性蛋白。

1.3.4黄豆中蛋白含量的确定

黄豆中总蛋白和可溶性蛋白的测定采用微量凯式定氮法，参照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

富硒黄豆蛋白提取率/ %=可溶性蛋白质含量/黄豆中总蛋白含量×100

1.3.5黄豆蛋白提取单因素试验

根据蛋白质溶解性的不同，本试验选择3种中性浸提剂分别为：pH=7.2的Tris/HCl缓冲液（Tris/HCl）、pH=7.2的磷酸缓冲液（PBS）、9 %的NaCl溶液（NaCl）。以提取黄豆蛋白的液料比、时间、温度为试验指标，分别做单因素试验，并分析各因素对黄豆蛋白提取率的影响。

1.3.6黄豆蛋白提取的响应面分析试验

在单因素试验的基础上，以蛋白质的提取率作为试验指标，根据中心组合设计（Central Composite Design），采用软件Design Expert V8.0.6建立三因素三水平试验，确定黄豆蛋白的最佳提取工艺。

1.3.7黄豆中蛋白硒的测定

在最佳浸提条件下提取富硒黄豆蛋白，取20 mL浸提液于聚四氟乙烯消化罐中，加5 mL HNO3和1mL H2O2置于微波消解仪中消化。微波消解程序及蛋白硒的测定方法见1.3.2。

2　结果与分析

2.1富硒黄豆中硒含量测定结果

采用微波消解与石墨炉原子吸收光谱法对富硒黄豆中的总硒量进行测定，对照组含硒量为58.67 μg/kg，而施硒量为10、20、40 mg/kg的黄豆中含硒量分别为177.58、322.76、629.33 μg/kg。可见随着土壤施硒量的增加，黄豆中的总硒量呈现上升趋势。

2.2富硒黄豆中总蛋白含量的测定结果

采用凯式定氮法对黄豆中蛋白进行3次测定，4组黄豆样品中总蛋白含量分别为37.18 %、38.80 %、39.54 %、39.02 %，说明施硒量的增加，在一定程度上会促进了蛋白的合成。

2.3黄豆蛋白质提取的单因素试验结果

2.3.1液料比对黄豆蛋白提取率的影响

准确称取对照组黄豆粉末3 g，按液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）加入浸提剂，在30℃振荡提取30 min，考察液料比对黄豆蛋白提取的影响。结果见图1。

如图1所知，通过3种浸提液提取黄豆蛋白比较，磷酸盐缓冲液的蛋白提取率较高。液料比为5∶1（mL/g）时，蛋白提取率较低，液料比达到10∶1（mL/g）时，蛋白提取率最高，随着液料比的增加，蛋白提取率没有明显变化。因此选择液料比为10∶1（mL/g）。

图1液料比对黄豆蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of soybean protein

2.3.2浸提时间对黄豆蛋白提取率的影响

准确称取对照组黄豆粉末3 g，加入30 mL的浸提液，在30℃下分别提取30、60、90、120、150 min，考察提取时间对蛋白提取率的影响。结果见图2。

图2提取时间对黄豆蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of soybean protein

由图2可知，相同条件下，3种浸提剂中，磷酸盐缓冲液的蛋白提取率最高，其次是NaCl和Tris-HCl。当提取液为磷酸盐缓冲液，提取时间为90 min时，蛋白提取率最大。随着提取时间的增加，蛋白提取率呈现先增高后降低的趋势。可能是随着浸提时间的增加，蛋白的溶出逐渐达到饱和，饱和之后因为长时间的振荡，蛋白质失活，进而使蛋白提取率降低。也有可能是由于液料比和浸提温度的增加，溶出的蛋白经长时间振荡出现凝聚引起再沉淀，从而降低了蛋白提取率。因此提取时间选择90 min。

2.3.3浸提温度对黄豆蛋白提取率的影响

准确称取对照组黄豆粉末3 g，加入30 mL浸提液，分别在20、30、40、50、60℃恒温提取30 min，考察浸提温度对黄豆蛋白提取率的影响。结果见图3。

图3提取温度对黄豆蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of soybean protein

由图3可知，磷酸盐缓冲液的蛋白提取率要明显高于其他2种浸提剂。随着温度的增高，蛋白提取率逐渐增加，但40℃时蛋白提取率开始下降，表明在上述介质中超过40℃就会使蛋白质逐渐变性凝固，降低蛋白溶解度。因此选择提取温度为40℃。

2.4黄豆蛋白提取工艺的优化

2.4.1回归模型的建立

综合单因素试验结果，选择磷酸盐缓冲液为最适浸提剂。选取温度、时间和液料比为考察因素，根据响应面分析法中心组合设计原理进行响应面试验，试验因素及水平见表2，响应面分析方案及试验结果见表3。

表2中心组合试验因素水平编码表Table 2 Factors and levels in the response surface design

表3响应面分析方案及试验结果Table 3 Design and results of the response surface methodology for Soybean protein extraction

对表3试验结果进行多元回归模拟，得到各试验因素对响应值的影响回归方程为：蛋白提取率=74.74+ 6.19A+4.92B+1.73C+1.15AB-0.23AC-0.045BC-7.64A2-3.42B2-1.38C2。通过Design-Expert软件进行方差分析来验证回归模型及各参数的显著性，结果见表4。

表4模型的ANOVA分析结果Table 4 Variance analysis（ANOVA）for the fitted quadratic regression model

由表4可知，回归方程中因变量和自变量之间的线性关系显著（R2=0.968 9），P=0.000 2<0.01，说明次方程极显著。失拟项P=0.015 6<0.05影响显著，表明此模型可分析和预测富硒蛋白提取工艺参数。

各因素的影响程度分析，模型中的A、B、A2、B2达到极显著水平，C、AB影响显著，AC、BC、C2影响不显著。由F值可知，影响蛋白质提取率主要因素依次是A>B>C，即液料比>浸提温度>浸提时间。

2.4.2响应曲面分析

根据回归分析结果，作出响应曲面图，响应面曲面的坡度可反映该因素对蛋白质提取率影响的强弱程度，如果一个响应曲面坡度相对平缓，表明其可以忍受处理条件的变异，而不影响到相应值大小，相反，如果一个响应曲面坡度非常陡峭，表明响应值对于处理条件的改变非常敏感。各因素对黄豆蛋白提取率的影响见图4～图6。

比较3组图可知：液料比对蛋白提取率的影响较大，曲线变化较陡；浸提温度次之；浸提时间对蛋白提取率的影响最小，曲面变化比较平缓。

2.4.3最佳提取条件及验证

图4液料比和提取温度对蛋白提取率影响的响应面Fig.4 Responsive surface of liquid/material ratio and temperature on protein extraction yield

图5提取温度和提取时间对蛋白提取率影响的响应面Fig.5 Responsive surface of temperature and time on protein extraction yield

图6液料比和提取时间对蛋白提取率影响的响应面Fig.6 Responsive surface of liquid/material ratio and time on protein extraction yield

由Design Expert V8.0.6分析软件得到的最佳浸提条件为：液料比为10.91∶1（mL/g），浸提温度为43.96℃，浸提时间为95.77 min，理论上蛋白提取率为78.59 %。为了考虑试验的可行性，将最佳条件调整为液料比为11∶1（mL/g），浸提温度为44℃，浸提时间为96 min。在此条件下，对对照组黄豆蛋白进行浸提，通过3次平行试验，测得蛋白提取率为76.03 %，相对误差为3.26 %，没有显著差异。

2.5富硒黄豆中蛋白硒的测定

在最优浸提条件下分别提取4组黄豆样品中的可溶性蛋白，对其蛋白硒的含量进行测定，结果见图7。

图7黄豆中的总硒量及可溶性蛋白的含硒量Fig.7 The concentrations of total-Se and protein-Se in soybeans

由图7可知，随着土壤施硒量的增加，蛋白硒的含量大幅上升，对照组蛋白硒含量为15.0 μg/kg，土壤施硒40 mg/kg的黄豆中蛋白硒含量达到60.30 μg/kg。但是，随着施硒浓度的增加，蛋白硒占总硒的比例呈下降趋势，对照组为25.57 %，而土壤施硒40 mg/kg的黄豆蛋白硒比例仅为9.58 %，说明在富硒黄豆样品中，非蛋白硒的比例远远大于蛋白硒。表明通过土壤施硒，能使硒在黄豆根茎组织代谢中进一步参与多种生物合成。

3　结论

1）在单因素试验的基础上，选择磷酸盐缓冲液为浸提剂，利用Design Expert V8.0.6分析软件进行优化分析得到：各因素对黄豆蛋白提取率影响大小的顺序依次是液料比、浸提温度、浸提时间。提取黄豆可溶性蛋白的最佳工艺参数为液料比11∶1（mL/g），浸提温度为44℃，浸提时间为96 min，在此条件下蛋白提取率达到76.03 %。表明响应曲面法对于黄豆可溶性蛋白提取条件的优化是可行的。

2）确定了蛋白最优浸提条件后，对4组黄豆中的蛋白硒含量进行测定，并与黄豆中的总硒量对比。结果表明，随着土壤中施硒量的增加，不仅黄豆中总硒量在增加，而且硒还促进了黄豆中蛋白的合成和蛋白硒的增加。

3）在富硒黄豆样品中，除蛋白硒以外还大量存在非蛋白硒，且随着黄豆中总硒量的增加，非蛋白硒增加的比例远远大于蛋白硒，表明富硒黄豆中不仅含有大量的蛋白硒，而且还存在着数量可观的其他有机含硒生物大分子。至于这些非蛋白硒的形态、结构还有待于进一步研究。

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Extraction of Soluble Selenium-containing Protein from Selenium-enriched Soybean

LI Bao-rui1，CHEN Yan-zhuo2，HAN Jie1，GAO Yu1，ZHANG An-ning1，TIE Mei1，*
（1 College of Environment，Liaoning University，Shenyang 110036，Liaoning，China；2 Liaoning Bihai Environmental Protection Engineering Supervision Company，Shenyang 110081，Liaoning，China）

Abstract：Soluble selenium-containing protein was extracted from selenium-enriched soybean by PBS（pH= 7.2）.The effects on protein extraction rate by the factors，such as liquid/ material ratio，temperature and extract time were studied. According to the single factor experiments，the optimum of extract process for seleniumenriched soybean protein was determined through Box-Benhnken central composite design and response surface methodology. The result showed that optimal condition of extraction were：liquid/material ratio 11∶1（mL/g）；extraction temperature 44℃；extraction time 96 min.Under the optimized extraction conditions，the yield of soluble selenium-containing protein was 76.03 %. Further studies showed：selenium-enriched soybean not only had selenium-containing protein，but also had other selenium-containing compounds.

Key words：selenium-enriched soybean；selenium-containing protein；extracting technology

收稿日期：2014-10-14

*通信作者

作者简介：李宝瑞（1988—），男（汉），硕士研究生，研究方向：土壤、农作物、食品中微量元素的检测方法、形态分析、迁移转化规律等。

基金项目：国家自然科学基金项目（31371085）；辽宁省科技厅项目（2011205001）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.015