丙酮萃取分光光度法测定水中叶绿素a实验条件的优化

李旭冉，梅鹏蔚，王琳，姜伟

(天津市环境监测中心，天津 300191)

丙酮萃取分光光度法测定水中叶绿素a实验条件的优化

李旭冉，梅鹏蔚，王琳，姜伟

(天津市环境监测中心，天津 300191)

基于丙酮萃取分光光度法，对叶绿素a测定方法进行深入研究，并通过单因素重复试验对冻存时间、冻存温度、萃取时间、萃取温度、细胞破碎方式、萃取剂浓度及萃取混合液提取方式等7方面的测定条件进行优化。优化后的实验条件为：水样经过抽滤后，置于-25 ℃低温冰箱中冻存12 h后取出，在常温下加入分析纯丙酮，用力振摇2 min至滤膜充分粉碎后定容到10 mL，静置不超过0.5 h，在离心机内以4 000 r/min的速度离心，取上清液进行比色。

叶绿素a；丙酮萃取；分光光度法

在养料丰富、流动缓慢的水中，浮游植物的大量繁殖及死亡是水体富营养化、水生生态系统失衡的主要诱因[1-3]。叶绿素a含量是反应浮游植物生物量和初级生产力水平最直接有效的指标[1]。故叶绿素a含量可作为评价湖泊富营养化的指标之一。

叶绿素a的测定方法主要有高效液相色谱法、荧光光度法和分光光度法等。环境领域应用最广的是丙酮萃取分光光度法[4]。该法灵敏度高，仪器设备简单，操作也简便。但存在在反复研磨过程中叶绿素a易发生光解，丙酮极易挥发并污染环境，浸提保存的时间和温度规定范围过于宽泛，具体操作的约束条件不够严格统一等问题，从而易引入较大误差，影响测定结果的准确性[5]。已有研究显示，用丙酮萃取叶绿素a，不同的萃取时间、萃取剂配比、萃取温度以及过滤方式均对叶绿素a的测定结果有影响[6-8]。因此，对丙酮萃取分光光度法分析叶绿素a的实验条件进行优化，对于提高测定结果的准确性具有重要的现实意义。

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

DR6000型分光光度计(美国哈希)；LD4-8型低速离心机(雷勃尔)；DJP-2001-1型真空泵(北京国环高科自动化技术研究所)；GLC-6型多联不锈钢过滤器(北京国环高科自动化技术研究所)；组织匀浆器；乙酸纤维滤膜(孔径0.45μm)。

碳酸镁粉末，丙酮(分析纯)。

1.2 样品采集

按照国家地表水相关水样采集技术规范采集水样。采样地点为天津市水上公园东湖，每批样品采集不少于5个平行样，单个水样体积不少于1L，采样后立即加入1%的碳酸镁试液固定，并在4 h内进行制样。

1.3 样品制备

通过抽滤，将水样中的浮游植物浓缩于乙酸纤维滤膜上后，将带有浮游植物的滤膜冻存一定时间，取出滤膜，在90%丙酮中通过研磨、静置等方式提取叶绿素a，然后通过离心、过滤等方式纯化萃取液，将上清液汇入容量瓶中定容后待测。

1.4 样品测定

将上清液置于1 cm光程的比色皿中，分别读取750，663，645和630 nm波长处的吸光度，并以90%的丙酮作空白吸光度测定，对样品吸光度进行校正。根据文献[9]计算水中叶绿素a质量浓度。

2 实验条件的优化

2.1 冻存时间

同批次采集30个平行样，随机分为6组，分别在-25 ℃冻存0，6，12，24，48和72 h，测得叶绿素a的结果见图1。由图1可见，冻存12 h叶绿素a的测定结果最大，标准偏差最小。这是因为冻存12 h，滤膜中剩余的水分已大部分升华，而浮游植物细胞的酶解反应尚未明显增强，故而对叶绿素a提取量的影响较小。因此，确定冻存时间为12 h。

图1 不同冻存时间下叶绿素a的测定结果

2.2 冻存温度

同批次采集15个平行样，随机分为3组，分别在-16，-20和-25 ℃冻存6 h，叶绿素a测定结果见图2。由图2可见，样品在-25 ℃冻存比在-16 ℃和-20 ℃冻存，叶绿素a的测定值更高，标准偏差更小。这是由于-25 ℃滤膜中浮游植物细胞内的酶活性被进一步抑制，酶解反应进一步减缓，减少了叶绿素a的损失。说明在更低温度下进行样品的冻存有助于得到更加满意的叶绿素a提取结果。故选择冻存温度为-25 ℃。

图2 不同冻存温度下叶绿素a的测定结果

2.3 萃取时间

同批次采集25个平行样，随机分为5组，分别在常温条件下用90%丙酮萃取10 min，0.5，1，2和4 h，叶绿素a测定结果见图3。由图3可见，当萃取时间在0.5 h以内时，测定结果相对稳定，标准偏差较小；当萃取时间超过0.5 h后，样品中叶绿素a的提取量明显降低，其测定结果也越来越不稳定，标准偏差均较大。故萃取时间不宜超过0.5 h。

图3 不同萃取时间下叶绿素a的测定结果

2.4 萃取温度

同批次采集10个平行样，随机分为2组，分别在常温[(20±5)℃]和50 ℃水浴条件下用90%丙酮萃取10 min，测定结果见表1。由表1可见，常温下叶绿素a的测定值更高，相对标准偏差更小。说明升高萃取温度并不能提高叶绿素a的萃取效率，相反，萃取温度升高到50℃左右时，会加速丙酮的挥发，并破坏叶绿素a的分子结构，降低方法的稳定性。故确定萃取温度为常温，即(20±5)℃。

表1 不同萃取温度下叶绿素a的测定结果

2.5 细胞破碎方式

同批次采集15个平行样，随机分为3组，分别采用组织匀浆器研磨、大功率超声仪超声处理 30 min和盖严盖子后在比色管中用力振摇2 min 3种方式进行细胞破碎，叶绿素a测定结果见表2。由表2可知，3种细胞破碎方式所得结果无明显差异，相对标准偏差均<5%，表明3种细胞破碎方式均具有较高的方法稳定性及精密度。只处理一个样品时，超声法耗时最长，手摇振荡法最短，组织匀浆器法操作更加剧烈，易使溶剂飞溅，造成玷污。因此，当样品量较少时，手动振荡2 min方式最省时，当样品量较大时，超声30 min更便于对样品进行批量处理。

表2 不同细胞破碎方式下叶绿素a的测定结果

2.6 萃取剂浓度

同批次采集10个平行样，随机分为2组，分别以90%丙酮溶液和分析纯丙酮作为萃取剂，二者对应叶绿素a的测定结果无明显差异(见表3)。由此可推知，在对水中浮游植物体内的叶绿素a进行提取时，二者在萃取效率、萃取体系的稳定性等方面均比较接近。因此，可以尝试以分析纯丙酮代替90%丙酮对此类样品进行叶绿素a的提取。

2.7 萃取液提取纯化方式

同批次采集10个平行样，随机分为2组，分别通过4 000 r/min离心和0.45 μm滤膜过滤的方式得到萃取物上清液，对应叶绿素a测定结果见表4。由表4可见，滤膜过滤法的相对标准偏差更大(>10%)，这说明通过0.45 μm滤膜滤去萃取体系中残渣的方式较不稳定。这可能是由于滤膜中的某些物质与丙酮溶剂相互作用，使滤膜部分溶解，使进行比色的滤液浊度明显增高而导致的。

表4 不同萃取液纯化方式下叶绿素a的测定结果

3 结果讨论

叶绿素a测定值的偏低主要由叶绿素a的降解引起。当细胞完全干燥时，引起降解的因素主要为光解和酶解[10]。通常状态下，叶绿素酶是一种潜状态酶，这种潜状态是由叶绿素酶与其底物叶绿素在空间位置上的隔离造成的[11]。当浮游植物细胞在体外尚未完全干燥时，过量的活性氧会加重细胞膜脂的过氧化程度和膜通透性，从而破坏这种“隔离”。“隔离”的崩坏促使叶绿素酶催化叶绿素及其衍生物侧链酯键进行水解，从而开启叶绿素酶促降解代谢过程[12]。

含叶绿素a的滤膜在经过抽滤和冻存后，仍含有少量的水分，在后续处理(如细胞破碎、萃取等)中发挥作用，使部分叶绿素降解，从而降低测定结果的准确性。这一影响会在样品低温干燥时，因水分随着时间的延长逐渐升华而逐渐减弱。与此同时，随冻存时间的延长，受酶解反应影响，冻存中的浮游植物的组织细胞结构越来越不稳定，其所含的叶绿素a损失量也越来越多。故叶绿素a的提取量主要受冻存温度和冻存时间的共同影响。

基于以上研究可知，优化细化操作步骤和实验条件可以有效提升丙酮萃取分光光度法测定叶绿素a的提取效率，增加方法的稳定性。

4 结语

通过单因素重复试验的方式，基于丙酮萃取分光光度法，在冻存时间、冻存温度、萃取时间、萃取温度、细胞破碎方式、萃取剂浓度、萃取液分离提纯方式等7个方面对叶绿素a测定方法进行了深入探讨。建议采用如下途径进行叶绿素a的测定：水样经过抽滤后，置于-25 ℃低温冰箱中冻存12 h后取出，在常温下加入分析纯丙酮，用力振摇至滤膜充分粉碎后定容到10 mL，静置不超过0.5 h，在离心机内以4 000 r/min的速度离心，取上清液进行比色。

手动剧烈振摇对滤膜中浮游植物细胞进行破碎，在样品量较少的情况下有效地提高了试验效率。

优化后的实验条件有效降低了滤膜中残存水分及所含杂质对叶绿素a测定的影响。后续研究，将尝试以冻干机内的快速冷冻干燥替代冰箱内冻存的步骤，进一步提高叶绿素a的提取效率。

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Optimization of the Experimental Parameters in the Determination of Chlorophyll-a in Water using Acetone Extraction Spectrophotometry

LI Xu-ran，MEI Peng-wei，WANG Lin，JIANG Wei

(TianjinEnvironmentalMonitoringCenter，Tianjin300191，China)

Based on acetone extraction spectrophotometry， the determination of chlorophyll-a was investigated in depth. Seven experimental parameters were optimized through single factor repeat experiments， including freezing time， extraction time and temperature， cell lysis approaches， extractant concentrations and extraction approaches. The optimized experimental procedures were as follows. Water samples were filtered and stored at -25 ℃ for 12 h. The samples were then allowed to restore to room temperature before adding acetone and shaken vigorously for 2 min until the membrane was crushed completely. Samples were diluted to 10 mL and rested aside for less than 0.5 h. Finally， the samples were centrifuged at 4 000 r/min and taken the supernatant for colorimetry.

Chlorophyll-a; Acetone extraction; Spectrophotometry

2015-10-18；

2016-03-21

李旭冉(1985—)，男，工程师，硕士，主要从事环境监测工作。

O657.32

B

1674-6732(2016)03-0025-03