节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

肖 敏，曾向萍，严婉荣，陈绵才，赵志祥＊，芮 凯

（1．海南省农业科学院植物保护研究所，海南海口571100；2．海南省植物病虫害防控重点实验室，海南海口571100）

节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性及其交互抗性

肖 敏1，2，曾向萍1，2，严婉荣1，2，陈绵才1，2，赵志祥1，2＊，芮 凯1，2

（1．海南省农业科学院植物保护研究所，海南海口571100；2．海南省植物病虫害防控重点实验室，海南海口571100）

为了对海南瓜类蔬菜炭疽病菌的抗性监测研究及抗性治理提供理论依据，对海南不同市县采集的节瓜炭疽病病样中分离纯化的90株炭疽病原菌进行了检测，采用菌丝生长速率法测定2种病原菌对嘧菌酯的敏感性。结果表明：经分生孢子形态鉴定节瓜炭疽病有胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．acutatum），胶孢炭疽菌为优势种群，占84．4%；2种病原菌对嘧菌酯的EC50在0．334 4～36．467 0μg／mL，平均为12．954 4μg／mL，敏感性分布接近于正态分布，EC50值之间表现较连续，故以平均EC50值为敏感性基线，用于节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的田间抗药性监测。嘧菌酯与多菌灵、福美双、丙环唑和咪鲜胺不存在交互抗性。

节瓜；炭疽病菌；嘧菌酯；敏感性；交互抗性

节瓜属葫芦科一年生攀援草本植物，是冬瓜的一个变种，形体从短圆柱形到长圆柱形，原产我国南部，是我国的特种蔬菜之一，在广东、广西、台湾已有多年栽培历史。节瓜具有清热、清暑、解毒、利尿、消肿等功效，是炎热夏季的理想蔬菜，其含钠和脂肪都低，常吃可起到减肥的作用。炭疽病（Anthracnose）是葫芦科瓜类蔬菜生产上的重要病害之一，也是节瓜的重要病害，种植地常发生。发病时常造成幼苗猝倒，成株茎、叶枯死及瓜果腐烂，有时症状会混合发生，危害严重。

生产中炭疽病主要以化学防治为主，常用的药剂有福美双、百菌清、多菌灵、苯菌灵、甲基硫菌灵、咪鲜胺和苯醚甲环唑等［1－2］，而在海南常使用嘧菌酯作为防治药剂。嘧菌酯为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，是一类能有效控制子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌危害的广谱性杀菌剂［3］。与苯并咪唑类、苯酰胺类、二甲亚胺类及DMI类杀菌剂无交互抗药性，在全世界被普遍使用。由于嘧菌酯作用位点单一，并且作用的靶标自发突变的频率较高，在高选择压力下，病原菌很容易产生抗药性的群体［4］。国内对西瓜、黄瓜、辣椒、芒果、柑橘炭疽病的研究多侧重于病害的发生识别、规律、药剂的室内毒力测定及化学药剂的防治方面［5－9］。黄树生等［10］通过田间试验比较啶氧菌酯、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、苯甲嘧菌酯5种药剂对西瓜炭疽病的控制效果，唐爽爽等［11］和胡育海等［12］进行了几种杀菌剂对西瓜炭疽病菌的毒力测定或配比试验，张令宏等［13］研究23种杀菌剂对8株抗多菌灵的芒果炭疽病菌的室内毒力及其交互抗性，杨叶等［14］对海南23株芒果炭疽病菌对多菌灵的抗药性进行了测定，詹儒林等［15］研究了来自广东和海南的芒果炭疽病菌对多菌灵的抗药性，但相关研究中节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性及相关性研究未见报道。因此，笔者通过生长速率法研究了海南节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性基线及其4种不同类型常用杀菌剂的交互抗性，为海南瓜类蔬菜炭疽病菌的抗性监测研究及抗性治理提供理论依据。

1材料与方法

1．1试验材料

药剂：95%嘧菌酯原药，98．4%多菌灵原药，96%福美双原药，97．8%丙环唑原药，96%咪鲜胺原药，以上5种原药均由中国农业科学院植物保护研究所提供。

试验用化学试剂：99%水杨肟酸、甲醇、丙酮、盐酸均为市售品。

PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g、琼脂粉20g，蒸馏水1 000mL，pH自然。

1．2病害样本采集、分离和鉴定

2013年从海南省海口、澄迈、定安、临高4市县节瓜种植地采集未施用过嘧菌酯的炭疽病病样，经过常规组织分离［16］、纯化、鉴定，并将纯化的菌株保存于4℃冰箱中备用。

1．3炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性测定

嘧菌酯浓度设为0、0．01μg／mL、0．1μg／mL、1μg／mL、10μg／mL和100μg／mL，先用甲醇溶解嘧菌酯原药，配制成1×104μg／mL的贮液待用，然后再配成所需浓度的平板，99%水杨肟酸溶于甲醇，配制成100μg／mL浓度的平板，以加水杨肟酸不加药为对照，每个处理3次重复。将待测的菌株在PDA培养基平板上培养5d，用无菌打孔器从菌落边缘打取直径5mm的菌块，用接种针挑取菌块，菌丝面朝下接种在培养基平板中央，培养皿直径90mm，每皿接1个菌块，每处理3皿。28℃培养7d后，采用十字交叉法测量菌落直径。计算生长抑制率，采用机率值分析法计算药剂对靶标菌菌丝的有效抑制浓度，根据抑制率计算其EC50值。

抑制率＝［1－（处理菌落直径－5）／（对照菌落生长直径－5）］×100%［17］

1．4嘧菌酯与不同杀菌剂的交互抗药性测定

用嘧菌酯的4个相对敏感和4个相对抗性的菌株，采用菌丝生长速率法，分别测定其对多菌灵、丙环唑、咪鲜胺和福美双的敏感性。

1．5数据的统计分析

采用SPSS统计分析软件，求出毒力回归方程y＝bx＋a及其各药剂的EC50（μg／mL）和相关系数，然后进行邓肯氏差异性显著分析。

2结果与分析

2．1病原种群类型

共分离纯化获得90株炭疽菌，经分生孢子形态鉴定，有胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C．acutatum）2种（图1），其中胶孢炭疽菌有76株，尖孢炭疽有14株，以胶孢炭疽为主，数量是总菌株的84．4%，为优势种群（表）。

图1 2种炭疽菌菌株的分生孢子形态Fig．1 Conidium morphology of two C．orbiculare strains

表 海南节瓜炭疽病菌种类Table Types of C．orbicularein zucchini in Hainan

2．2节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性

对90株炭疽菌进行敏感性测定，其EC50最大、最小和平均值分别为0．334 4μg／mL、36．467 0μg／mL和12．954 4μg／mL，标准差为8．027 4，最大值是最小值的109．05倍。在SPSS19．0统计软件中对EC50值进行单样本K－S正态性分布检验，得Kolmogorov－Smimov Z＝1．133，渐进连续性P＝0．153＞0．05，检验分布为正态分布，EC50值表现连续性。因此，平均EC50值（12．954 4±8．027 4）μg／mL，可作为节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性基线（图2），用于节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的田间抗药性监测。

2．3嘧菌酯与不同杀菌剂间的交互抗性

从图3敏感性的相关结果可见，嘧菌酯与多菌灵、丙环唑、咪鲜胺和福美双4试验药剂的相关系数分别为0．341 9、0．023 6、0．501 1和0．027 7。对其EC50值进行线性回归分析得出，嘧菌酯与上述4种药剂无显著相关性，说明嘧菌酯与这4种药剂之间不存在交互抗性。

图2 节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性频率分布Fig．2 Frequency distribution of sensitivity of C．orbiculare to Azoxystrobin

图3 嘧菌酯与不同类型杀菌剂的交互抗性Fig．3 Cross－resistance between Azoxystrobin and other four fungicides

3结论与讨论

1）节瓜上采集到的炭疽病菌有胶孢炭疽和尖孢炭疽两种，胶孢炭疽菌为优势种群。未分离到瓜类炭疽菌，而王会芳等［18］报道，2010年在海南苦瓜上分离鉴定到瓜类炭疽菌［Colletotrichum oribiculared（Berk．Mont）Arx］，这可能与采集的样本有关，而是否还有其他的病原菌种类，还有待于进一步监测。

2）李红霞等［4］在江苏海南采集到45株辣椒炭疽菌和胶孢炭疽菌，采用孢子萌发法测定2种菌对嘧菌酯的敏感性为（0．047±0．040）μg／mL，同时认为采用孢子萌发法比菌落直径法测定辣椒炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性更为科学，而本研究采用生长速率法测定采集到的2种炭疽菌对嘧菌酯的敏感性较高，这可能与采集地区、作物品种、使用方法、病原菌种类及当地用药历史不同有关，而对于节瓜炭疽病菌来说，哪种方法更为科学简便，还有待于研究。

3）海南种植节瓜面积逐年增大，发病率一般为10%～30%，严重时达70%～80%，轻则造成减产，影响品质，重则造成巨大损失。多菌灵、丙环唑、咪鲜胺和福美双是与嘧菌酯不同类型的杀菌剂，分属苯并咪唑类、三唑类、咪唑类和二硫代氨基酸盐类，不同杀菌剂作用方式、作用位点等的不同，抗药性也不尽相同。本研究通过试验明确了嘧菌酯与多菌灵、丙环唑、咪鲜胺和福美双之间无交互抗性。为了延缓该杀菌剂抗性的产生，可根据生产上病害发生情况采用不同作用机制的药剂轮换使用。生产上高效、内吸、选择性强的杀菌剂被广泛的应用，其抗药性越来越普遍和严重，使得化学防治失败，生产遭受重大损失。笔者通过测定海南地区节瓜炭疽病菌对嘧菌酯的敏感性，建立敏感性基线，通过早期监测，提出科学的用药方法，为抗性治理提供科学依据。

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（责任编辑：聂克艳）

Sensitivity of Colletotrichum orbiculareIsolated from Zucchini to Azoxystrobin and Cross－Resistance between Azoxystrobin and Other fungicides

X
IAO Min1，2，ZENG Xiangping1，2，YAN Wanrong1，2，CHEN Miacai1，2，ZHAO Zhixiang1，2＊，RUI Kai1，2
（1．Institute of Plant Protection，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou，Hainan571100；2．Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests，Haikou，Hainan571100，China）

The sensitivity of 90 C．orbiculare strains isolated and purified from zucchini samples infected with C．gloeosporioides and C．acutatumcollected from different cities（counties）in Hainan to Azoxystrobin by mycelial growth rate to provide the theoretical basis for resistance monitoring and management of melon vegetables against C．orbicularein Hainan．Results：There are C．gloeosporioides and C．acutatumin anthracnose of zucchini according to identification of conidium morphology．C．gloeosporioides is a dominant species and accounts for 84．4%．EC50of C．gloeosporioides and C．acutatum is 0．334 4～36．467 0μg／mL and their average EC50is 12．954 4μg／mL．The average EC50value is used as the sensitivity baseline because the sensitivity distribution is close to Gaussian distribution，which can be used to monitor resistance of C．orbiculare to Azoxystrobin in zucchini field．There is no cross－resistance between Azoxystrobin and Carbendazim，Thiram，Propiconazoie，Prochioraz respectively．

zucchini；Colletotrichum orbiculare；Azoxystrobin；sensitivity；cross－resistance

S436．429

A

1001－3601（2016）02－0071－0085－04

2015－05－02；2016－02－04修回

公益性行业（农业）科研专项“农作物重要病原菌抗药性监测及治理技术研究与示范”（201303023）；“十二五”国家科技支撑计划“热带蔬菜主要病虫害防控技术研究与集成示范”（2012BAD19B06－07）；海南省省属科研院所技术开发研究专项“北运瓜菜重大病虫害抗药性治理与农药残留控制技术研究”（KYYS－2015－01）

肖 敏（1970－），女，副研究员，从事植物病理学和病害综合防控技术研究。E－mail：xiaominnky＠21cn．com

＊通讯作者：赵志祥（1981－），男，副研究员，博士，从事植物病理学和微生物学研究。E－mail：zhaozhixiang0207＠126．com