锌指蛋白403对人U251胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

王佳胡晞袁鹏邓永兵

·论 著·

锌指蛋白403对人U251胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响

王佳*胡晞*袁鹏*邓永兵*

目的 研究锌指蛋白403（gametogenetin-binding protein 2，GGNBP2）表达水平对人胶质瘤细胞增殖，侵袭，迁移能力的影响。方法 培养人U251胶质瘤细胞，慢病毒转染构建稳定过表达GGNBP2的U251胶质瘤细胞后，qRT-PCR及Western Blot检测转染效率；CCK8检测细胞细胞增殖能力；Transwell小室法检U251胶质瘤细胞侵袭和迁移能力变化；Western Blot检测AKT,p-AKT,PCNA,MMP9表达水平的改变。结果 成功构建稳定过表达GGNBP2的人U251胶质瘤细胞株，与对照组和空载组比较，过表达组细胞增殖（P＜0.05），侵袭力（57± 6 vs.203±6，205±7，F=512.4，P＜0.05），迁移力(74±7 vs.254±14，248±13，F=242.5，P＜0.05）明显抑制;Western Blot结果显示，与对照组和空载组比较，过表达组p-AKT(F=45.4,P＜0.05)，PCNA(F=348.5,P＜0.05)，MMP9(F= 88.7,P＜0.05)表达水平明显降低。结论 GGNBP2可能通过抑制AKT的磷酸化水平，并经过相应的信号通路下调PCNA，MMP9表达水平，从而抑制胶质瘤细胞增殖，侵袭和迁移，提示GGNBP2可能成为胶质瘤治疗的潜在靶点。

GGNBP2胶质瘤 增殖 侵袭 迁移

脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，约占颅内原发肿瘤45%，患者中位生存期不足1年[1-3]。锌指蛋白403（Gametogenetin-binding protein 2，GGNBP2），定位于17q12～17q21.1,该区位于乳腺癌，前列腺癌和喉癌等肿瘤的遗传易感区域内[4]。研究发现，GGNBP2在多种正常组织内高表达，而在肿瘤中低表达，并参与肿瘤的发生发展[4,5]；然而，GGNBP2在胶质瘤中的表达及作用如何?本研究旨在探讨GGNBP2对U251胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用以及相关机制，为胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 10%FBS的DMEM培养基，常规加入青霉素-链霉素混合液（1：100），37℃、5%CO2的恒温孵箱中常规培养U251胶质瘤细胞（中国科学院上海细胞库）。

1.2 细胞转染 实验分3组：①以未感染病毒的U251细胞为空白对照组（对照组）；②以感染阴性对照慢病毒LV-NC（上海吉凯基因）的U251细胞为阴性对照组（空载组）；③以感染重组慢病毒LV-GGNBP2（上海吉凯基因）的U251细胞为GGNBP2上调组（过表达组）。将U251细胞接种于6孔板中，5×104个/孔，培养24 h后，分别加入感染复数（multiplicity of infection，MOI）为40的重组慢病毒LV-NPRL2和阴性对照慢病毒LV-NC，同时加入5.0μg/mL的Polybrene。继续培养12 h后，换新鲜的完全培养液继续培养。通过2.0μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，获得稳定感染的细胞。

1.3 实时荧光定量PCR检测U251中GGNBP2过表达效率 在对数期收集各组细胞，Trizol法提取细胞总RNA。按说明书（Takara）进行反转录和qRT-PCR反应。GGNBP2基因的上游引物序列为5'-TTATGAAGGCTTGCGGTGCT-3',下游引物序列为5'-ATGCCTTTCTCTTCGCCCTC-3',扩增产物长度为123 bp（大连宝生物）；内参照GADPH基因的上游引物序列为5'-ACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3'，下游引物序列为5'-ATACCAGGAAATGAGCTTGA-3',扩增产物长度为173 bp（大连宝生物）。PCR反应条件：95℃变性30s；95℃15 s, 60℃45s，共40个循环。以2-ΔΔCt值表示GGNBP2 mRNA的相对表达水平。

1.4 蛋白免疫印迹检测U251中GGNBP2过表达后相关蛋白表达 收集各组细胞，根据说明书提取细胞总蛋白。将各组蛋白于10%SDS-PAGE凝胶中电泳，电泳完成后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液室温下封闭1 h；一抗孵育过夜；TBST漂洗后，孵育二抗1 h（山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG，均为(1：5000）；TBST洗膜后用超敏ECL试剂发光显色，采集图像。各蛋白一抗稀释比例如下：GGNBP2 1：500（Sigma）、GAPDH 1：1000（碧云天）、p-Akt1 1：250（Cell Signaling Technology），Akt1 1：1000（Cell Signaling Technology），MMP-9 1：500（Abcam）、PCNA 1：500(Abcam)。

1.5 CCK8检测细胞增殖 将各组细胞接种于96孔板中，2000个/孔，每组设6个复孔。在细胞培养24、48、72和96h后，加入CCK-8试剂（上海碧云天）（10μL/孔），37℃反应1 h后，检测450nm波长处各孔的吸光度（OD）值。以时间为横坐标、OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。

1.6 Transwell小室法检测细胞侵袭和迁移 在孔径为8μm的小室内铺用无血清DMEM稀释的基质胶（基质胶：DMEM溶液=1：5）；取指数生长期的各组细胞，将浓度为1.25×105个/mL的细胞悬液400μL细胞种入上室，下室加入含10%血清DMEM 600μL；培养20h后，取出小室，PBS洗涤，棉签拭去小室上层未穿出细胞和基质胶，固定并染色。迁移实验与侵袭实验方法和步骤基本相同，差别在于上室不铺基质胶，上室种入细胞后常规培养7 h。观察照相，按每组不少于5个随机视野计数穿出细胞。实验重复3次。

1.7 统计学分析 本研究中的各项实验均独立重复3次。采用SPSS17.0对实验的结果数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间数据的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 qRT-PCR和Western Blot检测转染效率 建立稳定过表达GGNBP2的U251胶质瘤细胞株后，用实时荧光定量PCR检测GGNBP2 mRNA水平：对照组、空载组及过表达组中mRNA（1，0.86± 0.07,2.50±0.20，F=160.8，P＜0.05），差异有统计学意义。多重比较显示，过表达组mRNA水平明显高于空载组（P＜0.05）及对照组（P＜0.05），对照组与空载组mRNA无明显差异（P＞0.05）。Western Blot显示对照组、空载组及过表达组中蛋白水平（1，0.97±0.08,2.27±0.19，F=119.3，P＜0.05），差异有统计学意义。多重比较显示：过表达GGNBP2组蛋白水平较空载组（P＜0.05）和对照组明显提高（P＜0.05），而对照组与空载组mRNA无明显差异（P＞0.05）。见表1，图1。

2.2 GGNBP2的过表达抑制U251胶质瘤细胞增殖 运用CCK8增殖试剂盒检测GGNBP2对U251胶质瘤细胞增殖能力影响，结果显示：在各个时间点，F值分别为25.7,139.2,108.3,101.3(P＜0.05),进一步多重比较显示，各个时间点过表达组增殖明显低于空载组(P＜0.05)与对照组（P＜0.05）；而空载组和对照组之间的增殖能力无明显差异（P＞0.05），见表2。

2.3 GGNBP2的过表达抑制U251胶质瘤细胞侵袭和迁移 使用Transwell小室法检测U251胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力变化，结果显示：对照组、空载组及过表达组细胞数（侵袭：203±6，205±7，57±6，F=512.4，P＜0.05；迁移：254±14，248±13，74±7，F=242.5，P＜0.05）。进一步多重比较发现，与对照组和空载组相比，过表达组细胞穿过人工基底膜Matrigel胶和微孔膜的数目显著减少，侵袭（P＜0.05）和迁移（P＜0.05）能力均明显降低，而空载组与对照组侵袭（P＞0.05）和迁移（P＞0.05）能力无明显差异；以上结果表明GGNBP2能够显著抑制U251细胞的侵袭能力。此外，GGNBP2对U251胶质瘤细胞迁移能力的影响与侵袭能力相一致，也能够抑制U251细胞的迁移能力（表3，图2）。

表1 U251过表达GGNBP2 mRNA和蛋白改变

表2 GGNBP2对胶质瘤细胞增殖的影响（CCK8法）

图1 Western Blot检测GGNBP2过表达

2.4 GGNBP2的沉默降低PCNA、MMP9和PAKT的表达水平 结果显示，对照组，空载组及过表达组PCNA(F=348.5,P＜0.05)、MMP9(F=88.7,P＜0.05)表达具有明显差异，进一步多重比较显示，过表达组的PCNA和MMP9水平较空载组（P＜0.05）和对照组（P＜0.05）明显降低，而空载组与对照组之间无明显差异（P＞0.05）；同样，我们检测了PAKT表达情况，对照组，空载组及过表达组PAKT水平具有明显差异(F=45.4,P＜0.05)，多重比较显示过表达组的P-AKT表达水平较对照组（P＜0.05）与空载组（P＜0.05）明显降低，空载组与对照组之间无明显差异（P＞0.05）。见表4，图3。

图2 GGNBP2抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移。上图：GGNBP2抑制胶质瘤细胞侵袭；下图：GGNBP2抑制胶质瘤细胞迁移（100×）

图3 GGNBP2过表达抑制P-AKT,PCNA和MMP9

表3 GGNBP2对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响

3 讨论

GGNBP2定位于17q12～17q21.1,该区位于乳腺癌，前列腺癌和喉癌等肿瘤的遗传易感区域内, 2869bp，含有14个外显子，编码序列位置为317-2410，编码一个包含696个氨基酸的蛋白质。既往研究显示GGNBP2可以抑制宫颈癌的增殖，迁移和侵袭[4]。在胶质瘤中尚未见GGNBP2相关报道，其分子功能是否影响胶质瘤恶性生物学行为并不清楚。

胶质瘤细胞的增殖及侵袭在胶质瘤的恶性进程中起关键作用，是影响患者预后和存活的关键。因此，本课题组选用常见的U251胶质瘤细胞作为研究对象，成功构建稳定过表达GGNBP2的U251细胞株；通过CCK8和Transwell小室实验发现GGNBP2过表达可以明显抑制U251细胞增殖，迁移和侵袭（图2）；PCNA是Kononen等首先发现并命名,是一种小分子的核蛋白，与细胞DNA的合成关系密切，在细胞增殖过程中起重要作用,是评价细胞增殖状态的重要指标[6].基质金属蛋白(matrix metalloporteinases,MMPs)是高度保守的一类酶,多以酶原形式分泌,可以特异性降解细胞外基质中的一种或几种蛋白质，MMPs降解ECM是肿瘤细胞向瘤灶周围侵袭性生长的关键事件，其中MMP9与胶质瘤的侵袭性生长关系尤为密切。本实验通过Western Blot检测发现GGNBP2可以明显抑制U251胶质瘤细胞株内PCNA和MMP9的表达，与细胞功能学实验相一致，进一步证实GGNBP2抑制胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭。

既往研究表明AKT信号通路在多种肿瘤中被激活，参与肿瘤的发生发展[7]。在胶质瘤中AKT信号通路激活后可以促进胶质瘤增殖，迁移和侵袭[8]，因此推测GGNBP2是否可以抑制AKT信号来抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，故我们通过Western Blot检测发现GGNBP2可以明显抑制AKT磷酸化水平，导致AKT信号通路失活，证实GGNBP2可能通过AKT信号通路抑制胶质瘤细胞增殖，迁移和侵袭。

综上所述，GGNBP2在胶质瘤增殖、迁移和侵袭多个病理环节中均发挥重要作用，有望成为胶质瘤新的治疗靶点。然而，有关GGNBP2在胶质瘤进展中的研究报道并不多见。因此，GGNBP2在胶质瘤增殖、迁移和侵袭过程中的具体分子机制还有待于进一步研究。

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The effect and mechanism of GGNBP2 regulates the proliferation,invasion and migration of human U251glioma cells.

WANG Jia,HU Xi,YUAN Peng,DENG Yongbing.Department of Neurosurgery,The Emergency Medical Center of Chongqing,Chongqing 400016,China.Tel：023-63692117.

Objective To investigate the effects of GGNBP2 on proliferation，migration and invasion of human glioma U251 cells and the potential mechanism.Methods U251 glioma cells were transfected with lentiviral vector carrying GGNBP2 to establish a stable overexperssion of GGNBP2 in U251 cell line.After verification of the efficiency of transfection by real-time PCR,Western Blot,PCR and CCK-8 were applied to detect the proliferation of U251 cells.The Transwell chamber assay was applied to measure the migration and invasion of human U251 glioma cells.Western blot was applied to measure protein levels of AKT,p-AKT,PCNA and MMP9.Result The stable U251 glioma cell line overexpressing GGNBP2 was successfully established.Compared with the control group,overexpression of GGNBP2 significantly inhibited the proliferation（P＜0.05），invasion（57±6 vs.203±6，205±7，F=512.4，P＜0.05）and migration(74±7 vs. 254±14，248±13，F=242.5，P＜0.05）of U251 cells.The protein expression levels of p-AKT(F=45.4,P＜0.05),PCNA (F=348.5,P＜0.05)and MMP-9(F=88.7,P＜0.05)in GGNBP2 group were markedly decreased compared with the control group.Conclusion GGNBP2 may suppress the proliferation,invasion and migration of glioma though down-regulation of p-AKT,which in turn inhibits PCNA and MMP-9 expression.

G GNBP2 Glioma Proliferation Invasion Migration

R739.41

A

2016-10-31）

（责任编辑：甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.12.002

*重庆市急救医疗中心神经外科（重庆 400014）

（E-mail：sdwangjia@163.com）