手性药物与生物大分子相互作用中对映选择性的表征方法研究进展

卢蓝蓝， 陈佳虹， 刘英菊， 肖治理， 张炽坚， Sergei A Eremin， 孙远明， 雷红涛*

(1.华南农业大学食品学院，广东省食品质量安全重点实验室，广东广州 510642；2.华南农业大学理学院，生物材料研究所，广东广州 510642；3.A.N.Bach Institute of Biochemistry,Russian Academy of Sciences,Moscow,Russia 119071)

1 引言

药物小分子与生物大分子相互作用的研究是化学生物学的重要研究内容。生物大分子的分子量较大，结构也比较复杂，它们往往与一些特异性小分子(配体)结合，将引起蛋白质结合区域的构象变化，从而影响其他区域的构象[1，2]。在药物领域中，不同的对映体药物在人体内的药理、代谢过程、毒性和疗效存在着显著差异。在一对异构体中，通常是一种具有良好的生理活性，而另一种的活性很弱或没有活性，甚至还有毒副作用[3]。对此，1992年美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)规定，要求对手性药物的对映异构体进行定量和立体化学特殊的鉴定测试，同时检测单个对映体的药效学和药动学特征[4]。因此，建立精密、高效的手性药物分析技术，对手性药物的检测和纯化，进而深层次地研究手性药物与生物大分子的作用机制等均具有极其重要的意义。

一般，研究手性药物与生物大分子的作用机制主要是通过研究蛋白质在与手性药物结合后其结构和构象的变化情况。而研究蛋白质结构和构象的方法有很多，传统上可以分为两大类：一类是测定溶液中蛋白质分子的构象，如核磁共振法(NMR)[5]、平衡透析法[6]、傅里叶红外(FT-IR)光谱法[7]等；另一类是测定晶体蛋白质的分子结构，如X射线衍射法和小角中子衍射法。利用这些方法可以获得关于生物大分子与手性配体作用的结合常数、结合位点数、作用力类型以及在手性药物小分子作用下生物大分子结构与功能的变化等信息。本文重点阐述了分子光谱分析法、等温滴定量热法、手性传感器、原子力显微镜和分子对接模拟法作为手性药物与生物大分子相互作用中在对映选择性上的表征方法应用与进展。

2 分子光谱分析法

分子光谱分析是研究药物对映体和蛋白质相互作用的一种简单有效的方法。根据检测原理和仪器的差异可将光谱分析分为紫外-可见吸收光谱法[8]、荧光光谱法和拉曼光谱法[9]等。

2.1 荧光光谱法

荧光光谱法具有快速、简便、灵敏度高等优点，已成为分子光谱分析法中应用最广泛的一种方法[10]。该方法能够提供很多荧光参数，如激发光谱、荧光强度、量子产率、荧光寿命等，这些参数从各个角度反映了分子间的成键和结构情况以及发光特性。通过对这些参数的测定，不仅可以做一般的定量分析，还可以推断蛋白质分子在各种环境中的构象变化[11]，从而进一步阐明蛋白质结构与功能的关系[12]。

Ranieri等[13]通过荧光光谱法测定了抗体与芳香族氨基酸对映体结合前后色氨酸的荧光强度，发现抗体与D -苯丙氨酸结合后其色氨酸的荧光强度增大了，而与L-苯丙氨酸反应时则无明显变化，从而验证了色氨酸残基确实位于手性抗体结合位点。Grubor等[14]利用荧光线狭窄光谱(Fluorescence Line-Narrowing Spectroscopy，FLNS)研究了抗体与(+)-,(-)-Benzo[a]Pyrene Tetrol(BPT)对映体结合的识别机制，发现当抗体与(+)-BPT结合时，其复合物的FLNS光谱会出现明显的红移，而与(-)-BPT结合时则没有。通过分析表明(+)-BPT-Ab复合物出现红移是由于半抗原的芘基与抗体的结合位点形成了π-π共轭，而(-)-BPT与抗体结合时，其芘基远离了抗体的口袋结构，而更偏向于溶液部分，故其复合物的FLNS光谱没有变化。Liu等[15]采用荧光光谱分析、质子核磁共振分析对两种生物碱对映体Quinine(QN)和Quinidine(QD)分别与BSA的特异性结合进行了研究，结果表明两者通过静电力作用与牛血清白蛋白(BSA)结合，主要是芳香基团起作用，并导致BSA的二级结构发生变化。

2.2 圆二色谱法

圆二色谱(Circular Dichroism,CD)是立体化学和分子间相互作用的重要研究手段之一，主要是通过测定蛋白质在与手性药物结合后其空间结构(构象)的变化，通过数据拟合得出蛋白质的二级结构是否发生改变，从而认识到不同的药物对映体与蛋白质结合的作用机制是否是不同的[16]。目前，由于圆二色谱分析法具有快速、简单、准确等优点，在研究手性药物小分子对蛋白质二级结构变化具有重要的实际意义，引起了研究者的广泛关注[17]。

Hwangbo等[18]采用CD技术研究了R和S构型的氧氟沙星分别与合成的多聚核苷酸plo(A-T)、plo(G-C)、plo(C-I)的作用。最终所得的CD图谱表明，R-氧氟沙星仅与plo(G-C)作用明显，而S-氧氟沙星与三者作用皆很强，这说明核苷酸对S-氧氟沙星的立体选择性强。该实验结果也有力地证明了S-氧氟沙星的药效强于R-氧氟沙星这一已存在的结论。Zhang等[19]利用CD技术，结合稳态荧光、三维荧光、分子模拟等手段研究了禾草灵(Diclofop-methyl,DM)对映体和人血清白蛋白的相互作用，所得的计算结果表明自由的人血清白蛋白具有较高含量的α-螺旋，且S-DM比R-DM对人血清白蛋白的α-螺旋含量引起更大的改变。Monti等[20]采用CD和分子动力学分析了酮洛芬对映体(Ketoprofen,KP)和BSA的相互作用，通过计算得出S-(+)-KP更靠近子区域IIIA的酪氨酸-409，而R-(-)-KP更接近于子区域IIA的色氨酸-212和组氨酸-240，这一结果印证了等温滴定量热法得出的S-(+)-KP对蛋白质的亲和力比R-(-)-KP的弱。Tedesco等[21]利用CD法和时间密度泛函理论对非诺特罗对映体的立体结构和构象进行了研究，发现非诺特罗的CD图主要是由位于α位置的间苯二酚发色团手性中心的绝对构型占主导，从而导致其对β2-肾上腺素受体增效剂有特异性选择作用。

3 等温滴定量热法

等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry，ITC)是测量生物结合时相互作用的一种理想方法。ITC根据检测到的热效应中热力学分析来提供结合反应过程中能量变化的定量信息，可以直接计算溶液中两个或多个分子之间反应焓变(△H)、熵变(△S)、结合位点数(n)、结合常数(Ka)和动力学数据，从而得出反应吉布斯自由能(△G)，进一步判断蛋白质-小分子的反应类型[22]。ITC具有以下优点：(1)高灵敏度和精确度，响应时间低于10 s，结合常数检测范围可达109L/mol；(2)消耗样品量少，样品池只需200 μL样品；(3)实时监测和记录一个变化过程的量热曲线；(4)无需标记样品、无分子量和缓冲液体系限制，操作简便。目前，ITC已成为表征手性药物与生物大分子结合产生的反应热力学的方法中发展较快、应用较多的方法之一，广泛地运用到检测蛋白质相互作用、抗体质量控制、药物设计和酶动力学分析等方面[23 - 25]。

Dong等[26]以人工甜味剂富勒醇作为受体模型，用ITC研究了其对映体的结合亲和力差别。结果表明富勒醇与氨基酸的结合是一个熵增焓降的过程，同时D -果糖和L-半乳糖与富勒醇受体作用时结合常数比较大，这就解释了这两个单糖为什么比其对应的对映体更甜，这一结果填补了甜味评价的热动力学基础的空缺，揭示了氨基酸和单糖对映体甜度差别的原因。为了了解手性[5]螺稀-精胺共轭物对映体是否能识别B-或Z-DNA的手性，Tsuji等[27]成功合成了[5]螺稀-精胺共轭物(P)-3和(M)-3，同时(P)-3倾向于识别B-DNA，而(M)-3倾向于识别Z-DNA，结合热力学参数表明(P)-3、(M)-3对B-和Z-DNA的手性识别是由于精胺部分的阳离子在小沟的磷酸骨架处产生了静电作用，而螺稀以端部堆垛方式形成了复合物。Liu等[28]用等温滴定量热法和室温磷光法等技术比较了奎宁(QN)和奎尼丁(QD)这一对对映体与BSA的结合类型。结果表明QN和QD与BSA结合都是焓驱动的放热反应，而且QN比QD与BSA结合有更高的亲和力，这很好地解释了它们在药效上的差异，正是因为它们对生物大分子的不对等结合方式。

4 手性传感器

基于手性抗体的立体选择性，建立不同类型的手性传感器是分析和检测对映异构体的另一种方法。手性传感器具有三大优点：(1)高通量流动注射式检测，测量过程自动化；(2)无需对抗体或抗原进行任何标记；(3)可实时、在线进行对映异构体的检测[29,30]。基于表面等离子体共振光谱(Surface Plasmon Resonance,SPR)的手性光学传感器则是其中一种能实时监控手性抗体与对映体结合情况，并能定量检测对映异构体的手性传感器。SPR是一种折射率传感器，可根据共振角的变化反应基质对底物的吸附情况。Hofstetter等[31]先在镀金传感芯片上连接链霉亲和素的羧甲基葡聚糖，再络合上D -氨基酸。随着注入样品中D -氨基酸含量的增加，由于D -氨基酸与抗D -氨基酸抗体的竞争吸附作用，使得手性抗体与芯片的结合减少，导致传感信号逐渐减弱。另外，通过SPR测定氨基酸对映体时，当L构型为D构型的2 500倍时仍可准确测量，故该传感器也可用于测定痕量的对映体杂质。值得注意的是，SPR的实时监测功能还可提供手性抗体与手性半抗原的结合常数ka和解离常数kd，这对研究手性抗体与对映体之间的亲和力及识别性能差异等都有重要意义。

为了使SPR手性传感器在对映异构体的实际检测运用中更受青眯，更多其他类型的手性传感器应运而生。电容式手性传感器则是其中一种稳定、灵敏且价格便宜的能实现对映体痕量检测的手性传感器[32]。Zhang等[33]通过电容式手性传感器检测D,L-苯丙氨酸(D,L-Phe)对映体杂质的反应过程。当抗D -氨基酸抗体与金电极表面的手性半抗原结合时，根据电位阶跃法可计算出电容的变化△C，抗体结合越多，△C越大。随着注入样品中D -苯丙氨酸的浓度增加，抗体与金电极结合减少，导致△C逐渐变小。通过该方法能检测出在对映体杂质中含量只有0.001%的D -苯丙氨酸，灵敏度相当高，而且电容式手性传感器可以在温度变化较大或恶劣环境中工作，比SPR更适合于对映体杂质的实际、现场检测。

以上所介绍的手性传感器其检测过程均为直接竞争性检测，基于微悬梁臂结构的手性传感器还能实现直接非竞争性检测对映异构体。微悬梁臂是一种结构简单、易于进行微加工传感器结构。其以低成本、小体积和高性能著称[34]。Dutta等[35]将抗氨基酸抗体直接键合于微悬梁臂上，用以检测氨基酸对映体。当样品注入流经微悬梁臂时，氨基酸对映体与手性抗体结合，导致微悬梁臂发生暂时性的弯曲，通过激光束的反射探测微悬梁臂的偏转情况、偏转程度与样品中目标对映体的浓度成正比。

5 原子力显微镜

原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)则能够表征样品表面形貌、样品表面物化属性和样品表面电势等，了解样品表面分子的种类，从而得出与手性药物作用后蛋白质的表面形貌变化。AFM原理是用探针的一端固定在探针架上而另一端是装有纳米级针尖的微悬臂来检测样品表面形貌[36]。相比其它显微工具，原子力显微镜以其无需标记物、实时监测、高分辨、样品制备简单、成像环境多样、能获得样品的多种信息、能获得免疫分子识别情况、操作易行等特点而备受关注，已在生命科学、材料科学等领域发挥了重大作用[37,38]。

目前，在免疫分析过程中出现的假阳性、假阴性、共同表达等问题需要通过抗原及抗体高分辨率的成像来进一步解释，侯永微等[39]利用AFM对常用7种单克隆抗体进行扫描观察其形态，结果表明7种单克隆抗体的形态均不相同，这在形态上直观地印证了不同抗体的多态性及每种抗体具有相对特异性。这也表明利用AFM观察通过手性对映体得到的手性抗体形态，可以得到手性抗体形态的区别，从而去解释不同手性对映体在人体环境中的药理、代谢过程、毒性和疗效存在的差异。为了研究了DNA-多壁碳纳米管(DNA-MWNTs)复合物如何特异性区分青霉胺对映体(PA)，Wang等[40]采用AFM对固定有PA/DNA-MWNTs复合物的芯片表面进行观察，结果表明L-PA/DNA-MWNTs的表面比较紧凑，而D -PA/DNA-MWNTs的表面相对稀疏，这说明青霉胺对映体与芯片的不同组装方式是由于芯片上羧基和氨基与青霉胺对映体的手性碳原子在空间上的不同结合方式导致的，因此，可以利用AFM根据不同手性对映体与芯片的结合情况来区分不同的手性对映体。Wang等[41]采用基于自组装和AFM的单分子力谱技术和泊松分布统计法计算了BSA和anti-BSA在不同环境下的单分子对间的特异性相互作用力和非特异性相互作用力，该实验表明不同药物分子的存在对BSA和anti-BSA间相互作用的影响机制可能不同，这也说明可以利用AFM来研究不同药物分子对不同的手性分子和其对应的抗体间相互作用的影响机制，从而得到手性分子和其对应的抗体的作用力类型。

6 分子模拟

由于计算机技术及各种软件的开发，应用于研究小分子-蛋白的相互作用的分子模拟技术(分子对接)也越来越受到研究者们的广泛关注。由于蛋白质晶体结构研究的发展，已经探明了许多蛋白质三维结构。而当受体的三维结构已知时，可以根据形状互补、空间互补、性质互补的原则将配体放置在受体的活性部位，使之形成有利于相互作用的配体-受体复合物，即为所谓的分子模拟[42]。分子模拟可预测蛋白质的三维结构、蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA等生物大分子相互作用复合物的结构，小分子-生物大分子复合物的结构及相互作用的亲和性[43,44]。因而，该方法在设计半抗原、解释交叉反应与抗体识别机制等方面运用越来越广泛。

Rasmussen等[45]筛选了一些能够识别有疏水性的手性联二萘酚衍生物(BINOL)的抗体片段，用ELISA法来检测这些抗体片段的结合亲和力，并用分子对接技术去解释这些半抗原的结合方式。结果表明，由于半抗原本身的疏水性，有几个挑选的抗体具有立体选择性，只能识别(R)-BINOL衍生物且(R)-BINOL衍生物1的亲和力最好，但不能识别(S)-BINOL衍生物半抗原；而且根据半抗原与抗体识别的位点能够得出不同的结合位点是通过不同的结合方式完成的，这说明了能够利用抗体来区分具有强疏水性的配体对映体。Ranieri等[46]使用SWISS-MODEL软件研究了抗L-氨基酸单克隆抗体(anti-L-AA)的结合位点。对接结果表明anti-L-AA通过氢键和疏水作用与D -苯丙氨酸结合，但由于空间位阻而不能与L-苯丙氨酸结合，这说明手性抗体对D -苯丙氨酸的选择特异性是化学键和空间结构共同作用的结果。为了研究吡唑硫磷对映体不同的特异性毒理性质，Zhuang等[47]通过分子模拟在原子水平上研究了吡唑硫磷对映体与免疫细胞白介素1β(IL-1β)的结合情况，结果发现R-吡唑硫磷比S-吡唑硫磷更倾向于IL-1β蛋白结合，这解释了R-吡唑硫磷比S-吡唑硫磷有更强的毒性效应。

7 结语

随着实验技术、仪器设备的不断发展，整体实验水平不断提高，生物大分子-手性药物相互作用在对映选择性上的研究会越来越透彻，但由于研究中的蛋白质样液与蛋白质实际所处生理环境存在一定的差别，任何单一方法对生物大分子-手性药物小分子相互作用的研究结果都具有一定局限性。若把热力学方法、光谱技术、质谱技术、分子模拟技术等综合运用，从多方面多角度对同一反应体系进行研究，不仅能从宏观上，还可以从微观角度全面地对生物大分子-手性药物相互作用中的对映选择性进行分析，且不同的方法间也可相互佐证，所得到的结果就更加精准、更具说服力。