辅助生殖技术致胎盘葡萄糖转运载体基因表达水平上调

董杰，姜锋，陈书强，李博，孙惠君，王东，刘媛，周晶，王晓红

(第四军医大学唐都医院生殖医学中心，西安　710038)



辅助生殖技术致胎盘葡萄糖转运载体基因表达水平上调

董杰，姜锋，陈书强，李博，孙惠君，王东，刘媛，周晶，王晓红*

(第四军医大学唐都医院生殖医学中心，西安710038)

【摘要】目的探究经辅助生殖技术(ART)助孕足月分娩的新生儿与正常自然受孕足月分娩的新生儿的出生重量、胎盘重量、出生重量与胎盘重量比值及胎盘的葡萄糖转运载体基因表达是否存在差异。方法选择2014年8月至2015年1月在我院住院分娩的54例ART子代为ART组，同期住院分娩的100例自然妊娠子代为正常组。对两组出生体重、胎盘重量及出生体重与胎盘重量比值进行测量及统计分析，然后各组抽取20例样本，采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测两组新生儿胎盘组织中葡萄糖转运载体基因GLUT1、GLUT3、GLUT4及GLUT5 mRNA的表达水平，采用免疫印迹检测(Western Blot)方法验证GLUT1和GLUT3的蛋白水平。结果(1)ART组与正常组新生儿的出生体重、胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；(2)与正常组GLUT1与GLUT3的mRNA表达水平相比，ART组胎盘中GLUT1和GLUT3的mRNA表达水平均显著高于正常组(P<0.05)；而两组新生儿胎盘GLUT4与GLUT5的mRNA表达水平相比较，差异无统计学意义(P>0.05)；(3)ART组GLUT1蛋白水平显著高于正常组(P<0.05)，而GLUT3蛋白水平在两组间无统计学差异(P>0.05)。结论ART导致足月胎盘中葡萄糖转运载体基因GLUT1和GLUT3的表达增高，提示ART有可能会影响妊娠后期胎盘的葡萄糖转运功能。

【关键词】辅助生殖技术；胎盘；GLUT1；GLUT3；GLUT4；GLUT5

(JReprodMed2016，25(3)：258-263)

流行病学研究表明，胎儿子宫内发育时环境应激与成年后代谢性疾病显著相关[1]。基于这一发现，人们提出了“胚胎源性疾病”的假说，即在胚胎发育的关键阶段，若胎儿生长受到影响，将会导致出生后代谢性疾病的发生。研究表明，胎儿子宫内生长轨迹可以更好的评估胎儿在子宫内的应激状态，胎儿宫内生长轨迹的异常与出生后代谢疾病显著相关[2]。而胎儿在宫内的生长时期，胎盘在母胎营养资源分配方面起到关键作用，胎盘功能的改变会导致胎儿生长轨迹的异常[3]。

自1978年世界上第一个试管婴儿诞生后，全世界已经超过500万的试管婴儿诞生[4]。许多研究也证实了辅助生殖技术(ART)对于绝大多数的子代是健康的[5-6]。但研究也表明，与自然妊娠出生的子代相比，ART的子代低出生体重、出生缺陷、印记基因紊乱和胎盘异常的风险显著增加[7-9]。ART的子代在青少年时期就表现出糖脂代谢的异常[10]。另有研究表明，ART会显著影响人及动物宫内生长轨迹：ART受孕的胎儿在妊娠早期及中期表现为生长迟缓，在妊娠的后期表现为代偿性加速生长[2]。目前ART致胎儿宫内生长轨迹改变的相关机制仍不明确。动物模型研究认为，ART可以导致胎盘的结构异常形成，并且改变胎盘营养转运相关基因的表达，因此可能会影响胎儿的正常生长和发育[2]。本研究拟通过比较ART助孕与正常自然受孕分娩的足月新生儿的出生体重、胎盘重量、出生体重与胎盘重量之比及胎盘中葡萄糖转运体家族基因GLUT1、GLUT3、GLUT4和GLUT5的mRNA表达水平，并验证GLUT1和GLUT3的蛋白表达水平，探究ART对胎儿、胎盘发育及胎盘葡萄糖转运载体表达的影响，从而初步揭示ART致胎儿宫内生长轨迹改变的分子机制。

资料与方法

一、研究对象

选择2014年8月至2015年1月在我院住院分娩的54例ART子代为ART组，同期住院分娩的100例自然妊娠子代为正常组。两组均为足月、单胎妊娠，母亲无肥胖、糖尿病和高血压等妊娠合并症，新生儿外观无明显畸形。所有标本均经患者及家属知情同意，本研究获得我院伦理委员会批准。

二、主要试剂和仪器

RNA的抽提采用TRIzol®Reagent(Invitrogen，美国)，兔抗人GLUT1多克隆抗体，兔抗人GLUT3多克隆抗体，兔抗人GAPDH多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，AIphaimage2200电泳胶用凝胶成像分析系统(Innotech，美国)，ND2000分光光度计(Thermo，美国)，逆转录试剂盒(Thermo Fisher，美国)，荧光聚合酶链反应试剂(TaKaRa，日本)，CFX96实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)，BIO-RAD ChemiDox XRS凝胶成像系统(BIO-RAD，美国)。

三、研究方法

1. 标本采集：记录产妇基本临床信息，待胎儿分娩后，立即称取新生儿出生体重及胎盘的重量。胎盘娩出后立即剪取位于脐带附着处的胎盘小叶，去除母体蜕膜层，将胎盘绒毛于4℃磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗。洗净血迹后将组织以每块约1 cm×1 cm×1 cm的大小，分装并冻存于液氮中。0.5 h后转移至-80℃冰箱储存备用。

2. 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术检测目的基因mRNA的表达：(1)胎盘组织中RNA的提取：采用TRIzol法提取胎盘组织中总RNA，大约每100 mg胎盘组织中加入TRIzol 1 ml，利用ND2000分光光度计测定OD260/OD280，当比值在1.8～2.0时说明RNA的纯度较好，计算获得核酸量，并经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，样本符合测定标准后进行后续操作。(2)逆转录：每例标本取1 μg RNA样本加入至20 μl体系中进行逆转录反应，严格按逆转录试剂盒说明书要求进行操作。(3)RT-qPCR：引物序列根据PrimerBank上所查的序列，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下表1。反应体系如下：PCR特异上、下引物按1∶1比例混合后取1.5 μl，cDNA模板1.5 μl，荧光染料SYBR Green 10.0 μl，加灭菌蒸馏水7.0 μl至总体积为20.0 μl。每例样本均设3个平行复孔，取平均值。PCR反应条件如下：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45个循环，随后72℃延伸2 min。反应结束后记录扩增曲线和熔解曲线，以确定样本扩增的特异性。根据PCR扩增曲线，得到每个样本的循环阈值(Ct值)，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达水平。

3. 免疫印迹检测(Western Blot)方法验证目的蛋白的表达：(1)提取胎盘组织蛋白质后BCA法测定总蛋白浓度。(2)一抗采用兔抗人GLUT1多克隆抗体(1∶200)、兔抗人GLUT3多克隆抗体(1∶400)，以兔抗人GAPDH多克隆抗体(1∶5 000)为内参照。(3)采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭、孵一抗、洗膜、二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)结合、显影剂定影后，扫描结果与GAPDH相比较进行半定量分析。

4. 观察指标：比较两组母亲年龄、孕周、母亲体重质量指数(BMI)、新生儿体重、胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比。每组再抽选20例样本对两组新生儿胎盘组织中葡萄糖转运载体基因GLUT1、GLUT3、GLUT4及GLUT5的mRNA表达水平进行检测分析，并对GLUT1和GLUT3的蛋白水平进行验证。

四、统计学方法

结果

一、两组产妇基本临床资料、新生儿体重、胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比的比较

ART组产妇年龄显著高于正常组年龄(P<0.01)，但两组孕周和BMI值均无显著性差异(P>0.05)。比较ART组和正常组新生儿出生体重和胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比，发现ART组新生儿出生体重略低于正常组，而胎盘重量和新生儿出生体重与胎盘重量之比高于正常组，但差异无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表1　目的基因引物序列

表2　比较两组产妇基本临床资料、新生儿体重、胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比(x-±s)

注：与正常组比较，*P<0.01

二、两组胎盘中GLUT1、GLUT3、GLUT4及GLUT5基因的mRNA表达

从两组样本中各抽取的20例样本，保证两组的母亲年龄、孕周及母亲BMI均无明显差异(P>0.05)，比较两组新生儿出生体重和胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比，结果显示两组无显著性差异(P>0.05)(表3)。再分析比较ART组和正常组胎盘目的基因的mRNA的表达水平，结果显示两组GLUT1和GLUT3的mRNA表达水平具有显著性差异(P<0.05)。同正常组相比，ART组GLUT1的mRNA平均表达量(0.88±0.34)显著高于正常组(0.58±0.36)(P<0.05)，ART组GLUT3的mRNA平均表达水平(1.02±0.46)也显著高于正常组(0.72±0.35)(P<0.05)。而ART组GLUT4和GLUT5的mRNA表达量在两组之间，差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。本实验还检测了ART组与正常组的GLUT2在胎盘组织中的表达，由于含量过低，Ct值较高，达不到实验要求而放弃比较。

三、比较两组胎盘中GLUT1和GLUT3基因的蛋白表达

与正常组比较，ART组GLUT1的表达量增高，差异具有统计学意义(P<0.05)，而ART组GLUT3的表达水平无显著性差异(P>0.05)(图2、图3)。同正常组相比，ART组胎盘GLUT1(2.60±1.19)的蛋白表达量显著高于正常组(1.48±0.92)(P<0.05)，而ART组与正常组胎盘GLUT3的蛋白表达水平[(1.89±0.68)vs.(1.75±0.54)]，两组间无统计学差异(P>0.05)(图3)。

表3　产妇基本临床资料、新生儿体重、胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比比较(x-±s)

与正常组比较，*P<0.05图1　正常组和ART组mRNA相对表达量的比较

图2　正常组和ART组GLUT1和GLUT3的蛋白表达

与正常组比较，*P<0.05图3　正常组和ART组GLUT1和GLUT3蛋白相对表达量的比较

讨论

本研究通过比较ART助孕和和正常自然受孕分娩的足月新生儿的出生体重、胎盘重量、出生体重与胎盘重量之比及胎盘中葡萄糖转运体家族基因GLUT1、GLUT3、GLUT4和GLUT5的表达水平，发现两组新生儿出生体重、胎盘重量及新生儿体重与胎盘重量之比无显著性差异，同时，两组胎盘上GLUT4和GLUT5的mRNA表达量也无显著性改变。但是与正常组相比，ART组胎盘上GLUT1和GLUT3的mRNA表达水平显著增高，并且ART组GLUT1的蛋白水平也明显增加，提示ART可能通过改变胎盘葡萄糖运输载体基因的表达，影响了妊娠后期胎盘的葡萄糖转运功能。

许多研究表明，宫内环境应激与成年后代谢性疾病密切相关。宫内生长轨迹(intrauterine growth trajectory)是评估宫内环境应激的指标，ART可导致个体代谢疾病风险增加，胎儿宫内生长轨迹的改变[2]。但ART导致宫内胎儿生长轨迹改变(表现为妊娠早期及中期生长迟缓，妊娠后期代偿性加速生长)的具体机制未知。本研究发现，与自然妊娠新生儿相比，ART助孕的足月新生儿体重、胎盘重量及新生儿体重/胎盘比值并无明显改变，即未发现胎儿和胎盘在妊娠后期出现代偿性加速生长，与文献 [11] 的报道结果并不十分一致。Haavaldsen等[11]的研究表明，同自然妊娠相比，ART的子代胎盘重量显著增高，但新生儿体重无差异性，而新生儿体重与胎盘体重之比则显著性下降，本报道与其不一致的原因可能在于本研究的样本数目偏少，尚不能发现两者之间的差异性。

葡萄糖作为胎儿生长发育的主要营养物质之一，其从母体转运至胎儿，主要依赖胎盘表面营养转运体的易化扩散能力，因此胎盘葡萄糖转运载体对满足胎儿生长发育的能量需求极为重要[12]。GLUT1和GLUT3在胎盘组织表达量较高，在胎盘转运葡萄糖的过程中起着主要作用[13]。GLUT1主要分布在胎盘的合体滋养层微绒毛面和基底膜面，并且具有很高的表达量。足月时GLUT1在微绒毛面上的表达量约是其在基底膜的3倍，这种不对称性分布，能够快速调节胎盘两侧的葡萄糖水平，有利于胎儿处于一种适宜的葡萄糖环境当中生长[14]。GLUT3在组织中也广泛表达，并且对葡萄糖的亲和力很高，随着妊娠这一过程的推移，GLUT3的表达逐渐减少[15]，符合生命早期的发育特点，胚胎发育早期是处于一种低氧低营养物质供应的状态，而GLUT3与底物葡萄糖具有高度亲和力，可以满足胚胎的早期发育。在本实验研究中发现，GLUT1和GLUT3在妊娠末期ART胎盘中mRNA水平表达高于自然妊娠胎盘，并且ART组胎盘GLUT1的蛋白表达也增高，但GLUT3的蛋白水平无明显改变，可能与GLUT3的基因表达受到转录后调控有关。ART组GLUT1的表达增高可能是ART胎盘早期生长发育受到影响，达不到自然妊娠发育的胎盘的营养转运效率，机体通过自身的适应性调整，使在妊娠后期ART胎盘表面的葡萄糖主要转运载体GLUT1的表达出现增高，这样可以满足胎儿对葡萄糖营养物质的需求，保证胎儿的正常生长发育。因此，ART胎盘中GLUT1的表达增高可能与ART胎儿妊娠后期代偿性加速生长相关。

GLUT4和GLUT5在胎盘组织中表达量均较低[16]，关于其在胎盘表面的作用特点、转运效率的相关研究较少。本研究中GLUT4和GLUT5的表达水平在两组之间没有显著性差异。GLUT4是胰岛素依赖性的葡萄糖转运体[15]，可能由于ART组胎盘上GLUT4对胰岛素的反应未发生明显改变，GLUT4的表达未受到影响。GLUT5是一种果糖运输载体，与果糖具有很高的亲和力[17]，根据本实验研究结果，GLUT5在ART子代胎盘上的表达无明显改变，表明ART组胎盘在运输果糖的过程中未受到影响。因此，ART胎儿在妊娠后期代偿性加速生长可能与GLUT4和GLUT5的表达无关。

在动物模型中，Bloise等[18]小鼠实验研究中，发现ART胎盘妊娠后期代偿性增大，以补偿胎儿的生长。Haavaldsen等[11]的研究与本研究均表明，人类ART来源的胎盘增重并不像小鼠那样明显。这表明，人与小鼠的补偿机制并不相同，小鼠通过胎盘代偿性增大，增加母体对胎儿营养物质的运输，而人类胎盘重量并不明显增加，而是靠代偿性增加胎盘营养物质运输通道基因的表达增加营养物质的运输，满足胎儿后期代偿性加速生长的需要。

本研究发现ART可导致人类妊娠后期胎盘葡萄糖运输载体基因表达水平的升高，初步揭示了ART致人类妊娠后期胎儿代偿性加速增长的分子机制。后期还需进行实验研究ART胎盘的表观遗传学是否发生改变，进一步阐明ART致妊娠后期胎儿代偿性加速增长的分子机制，可望为试管婴儿预防成年后罹患代谢性疾病的发病机制提供理论依据。

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[18]Bloise E，Lin W，Liu X，et al. Impaired placental nutrient transport in mice generated by in vitro fertilization[J]. Endocrinology，2012，153：3457-3467.

[编辑：郭永]

Glucose transporter genes up-regulation in placeta derived from assisted reproductive technologies

DONGJie，JIANGFeng，CHENShu-qiang，LIBo，SUNHui-jun，WANGDong，LIUYuan，ZHOUJing，WANGXiao-hong*

ReproductiveMedicalCentre，TangduHospital，theForthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710038

【Abstract】

Objective： To determine whether assisted reproductive technology (ART) affects the birth weight，placental weight，ratio of fetal/placental weight and the expression of placental glucose transporter genes of singleton full-term neonates.

Methods： The birth weight，placental weight and ratio of the fetal/placental weight were compared between 54 singleton full-term neonates derived from ART (ART group) and 100 singleton full-term neonates naturally-born (control group). Then，20 placentas were selected from each group for detecting the expressions of placental glucose transporter genes (GLUT1，GLUT3，GLUT4 and GLUT5) by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The protein expressions of GLUT1 and GLUT3 were confirmed by Western Blot.

Results： There are no significant differences in new birth weight，placental weight and ratio of fetal/placental weight between the ART group and the control group (P>0.05). Compared with the control group，the mRNA expressions of GLUT1 and GLUT3 in placenta were significantly up-regulated in ART group (P<0.05). However，there was no significant different in the mRNA expression of GLUT4 and GLUT5 between the two groups (P>0.05). The protein expression of GLUT1 in ART group was significantly higher than that in the control group (P<0.05)，whereas GLUT3 protein expression did not significantly different (P>0.05).

Conclusions： The expressions of GLUT1 and GLUT3 are significantly increased in the placenta derived from ART，which suggests that ART may affect the placental glucose transport in later gestation.

Key words：Assisted Reproductive Technologies；Placenta；GLUT1；GLUT3；GLUT4；GLUT5

【作者简介】董杰，男，湖北武穴人，硕士，生殖内分泌专业.(*通讯作者)

【收稿日期】2015-08-04；【修回日期】2015-10-29

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.3.012