康卫氏平皿扩散法定量检测血液制品中乙醇残留量

王　霞，公　莹，李荣贞，张晓杰



康卫氏平皿扩散法定量检测血液制品中乙醇残留量

王霞，公莹，李荣贞，张晓杰＊

［摘要］目的建立定量测定血液制品中乙醇残留量的方法。方法运用改进的康卫氏皿扩散法测定血液制品中乙醇残留量。结果本法平均回收率及RSD%分别为101.26%±1.63%，1.61%，线性范围在0.05399～0.5399 mg/ml，本方法重复性、稳定性、准确度较好。结论康卫氏皿扩散法可用作定量检测血液制品中乙醇残留量的方法。

［关键词］血液制品；康卫氏皿扩散法；乙醇残留量

［作者单位］271000山东泰安，山东泰邦生物制品有限公司（王霞，公莹，李荣贞，张晓杰）

Determination of alcohol residue in blood products by using Conway＇s dish diffusion method

WANG Xia，GONG Ying，LI Rong－zhen，et al.Shandong Taibang Biological Products Co.，Ltd，Taian，Shandong 271000，China

［Abstract］ObjectiveTo establish a method for determination of alcohol residue in blood products.Methods Conway＇s dish diffusion method was adopted for determining alcohol residue.Results In this method the average recovery rate and coefficient of variation were 101.26%±1.63%，1.61%respectively，linearity range was 0.05399－0.5399 mg/ml.This method reproducibility，stability，and accuracy were all showed better.ConclusionCouway＇s dish diffusiou method could be used in detection of alcohol residue in blood products.

［Key words］Blood products；Conway＇s dish diffusion method；Alcohol residue

目前血液制品的生产大都采用低温乙醇法，但在工艺过程中并不能完全去除残留乙醇［1－3］。由于残留乙醇可能增加血液制品的不稳定性，且具有不良反应，故对血液制品中的残留乙醇应进行控制。目前对血液制品中乙醇的残留检测主要在制剂生产过程中，对血液制品成品乙醇残留及半成品定量的检测鲜有报道。气相色谱法是测定易挥发性有机溶剂常用方法，但测定含有蛋白类的复杂水溶液体系中的乙醇残留量较为困难［4］。康卫氏皿扩散法广泛应用于食品水分等的检测［5，6］，本文运用改进的康卫氏皿扩散法，利用乙醇在饱和的碳酸钠溶液中加热逸出，被重铬酸钾－硫酸溶液吸收呈黄绿色至绿色，用比色法对两种血液制品进行了残留乙醇定量检测［7］，方法简便、准确、重复性好，可用作血液制品中乙醇残留量的定量检测。

1　材料与方法

1.1样品人血白蛋白、静脉注射人免疫球蛋白（pH4）成品及半成品为山东泰邦生物制品有限公司产品。

1.2主要试剂及仪器TU－1901紫外－可见分光光度计（北京普析），电子分析天平（梅特勒）；无水乙醇（色谱级，批号：20140106，纯度＞99.9%），硫酸、重铬酸钾、无水碳酸钠均为分析纯（AR），纯化水。

1.3溶液配制

1.3.1试剂配制（1）饱和碳酸钠溶液：等量碳酸钠溶于等量纯化水中。（2）重铬酸钾－硫酸溶液：取重铬酸钾3.7 g溶于150 ml纯化水后加入硫酸280 ml，放冷纯化水定容至500 ml。

1.3.2对照溶液配制精密称取无水乙醇0.5399 g，置于已加入适量纯化水的10 ml量瓶中，纯化水稀释定容并摇匀，此为对照储备液。分别量取对照储备液1.00、0.80、0.50、0.30、0.10 ml配制浓度分别为0.5399、0.4319、0.2700、0.1620、0.05399 mg/ml的系统对照溶液。

1.4样品处理精密量取样品1.5 ml，按药典2010年版三部附录ⅥD处理［7］。

1.5测定波长的选择将对照品溶液在450～800nm波长范围内进行扫描，取重铬酸钾硫酸溶液按照1.4项下方法处理作为空白。

1.6标准曲线的绘制取系列对照溶液各1.5 ml，按1.4项下方法处理，以吸光度y对浓度x进行线性回归。

1.7方法的验证

1.7.1重复性验证将1.4项法处理好的人血白蛋白样品6次进样检测，记录吸光度，计算乙醇残留量及RSD。

1.7.2稳定性试验将1.4项法处理好的人血白蛋白样品放置0、4、8、12、16、20 h，取样进行检测。

1.7.3准确性验证配制高、中、低3个浓度水平的标准品：0.22、0.20、0.18 mg/ml，分别取1 ml与已知乙醇残留量的样品（编号2人血白蛋白半成品）1 ml混合，按1.4项方法处理并依照上述步骤测定，样品乙醇含量3次取平均，每个加对照的样品平行测定3次，计算其回收率及RSD。

1.8方法的初步应用取人血白蛋白、静脉注射人免疫球蛋白成品及半成品共10批，测定乙醇残留量。

2　结果

2.1最大吸收波长（λmax）及线性范围450～800nm波长范围内扫描得到λmax约为600 nm，这与药典给出的测定波长650 nm有出入，可能与所扫描的样品浓度有关，线性方程y＝0.2464x－0.01263，r＝0.9973，线性良好，范围为0.05399～0.5399 mg/ml。

图1　波长扫描

图2　标准曲线

2.2方法的验证结果

2.3.1重复性同一试样6次乙醇残留量相对标准偏差为2.45%（n＝6），测定结果见表1。

表1　重复性实验

2.3.2稳定性样品溶液放置4℃，在0、4、8、12、16、20 h，进行样品测定，乙醇残留量相对标准偏差为2.79%，测定结果见表2。

表2　稳定性实验

2.3.3准确性结果表明，高、中、低3个浓度水平的回收率在99.22%～103.72%之间，平均回收率为101.26%±1.63%，RSD为1.61%，表明所采用的样品处理方法及光谱条件均具有较好的可靠性，测定结果见表3。

表3　乙醇回收率试验结果

2.4方法的初步应用测定结果显示人血白蛋白乙醇残留量要高于静脉注射人免疫球蛋白（pH4）乙醇残留量，这与静脉注射人免疫球蛋白（pH4）层析工艺应该有关，10批次样品的乙醇残留量最高为编号2的人血白蛋白半成品（0.00797%），最低为编号1的静脉注射人免疫球蛋白（pH4）成品（0.0055%），均远远低于药典的半成品限量要求（0.025%），结果见表4。

3　讨论

乙醇残留量的定量测定大都采用气相色谱法［8－11］，血液制品主要活性成分为蛋白类，由于蛋白质的热不稳定性，气相色谱法定量检测含有蛋白水溶液制品的乙醇残留量较为困难。对于血液制品中特别是半成品乙醇残留量控制上，目前我国生物制品行业中均采用康卫皿扩散法且为非定量检测［7，12］，而对血液制品乙醇残留定量没有要求或少有文献报道。本文改进的康卫皿扩散法可准确的定量乙醇的残留量，10批次样品的乙醇残留量最高为编号2的人血白蛋白半成品（0.00797%），均远远低于药典的半成品限量要求（0.025%），且准确性试验回收率101.26%±1.63%，RSD为1.61%定量准确；重复性及稳定试验RSD＜3%，试验稳定。

实验证明，运用改进的康卫氏皿扩散法定量测定血液制品中乙醇残留量，重现性好，定量准确，易于操作，可用于血液制品中乙醇残留量的检测。

表4　样品中乙醇残留量的测定结果

参考文献

［1］WHO.Guidelines on Virus Inactivation and Removal Procedures intended to assure the Viral Safety of Human Blood Plasma Products［M］.Expert Committee on Biological Standardization，Geneva，2010：26－30.

［2］喇文军，王妍，周靖，等.一步柱层析纯化血浆分离多种血液制品组分［J］.中国生物制品学杂志，2015，28（2）：194－198.

［3］辛暨华，全爱顺，周丽薇，等.应用气相色谱法监测血液制品中乙醇残留量［J］.中国生物制品学杂志，2002，15（3）：180－181.

［4］唐妮，魏俊富，张环，等.填充柱色谱法精确测定乙醇/水体系中的醇水含量［J］.天津工业大学学报，2012，31（3）：44－47.

［5］赵世民.康卫氏皿扩散法测定荞麦粉的水分活度［J］.安徽农业科学，2012，40（5）：2901－2902.

［6］邓新煜，曹明明，宋健.康卫氏皿扩散法测定馅料的水分活度研究［J］.安徽农业通报，2013，19（09）：143－144.

［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［8］肖树雄，莫结丽.顶空气相色谱法测定参芪扶正注射液中乙醇残留量［J］.中国药师，2010，13（12）：1763－1764.

［9］梁选革，冯俊富，张若燕，等.顶空气相色谱法测定清开灵注射液中乙醇的残留量［J］.医药导报，2013，32（12）：1628－1629.

［10］解润芳，李慧，方洁，等.直接进样气相色谱法测定全血中乙醇的含量［J］.中国法医学杂志，2014，29（6）：553－555.

［11］代娟，陈曼，赖翼，等.直接进样毛细管气相色谱法测定血液中乙醇含量的研究［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（2）：283－284.

［12］Kanako WS，Hiroshi S，Akira I.UItra－sensitive methed for determination of ethanol in whole blood by headspace capillary ga chromatography with cryogenic oven trapping［J］.J Chromato B Bio med Sci Appl，1999，727（1－2）：89－94.

［2015－07－14收稿，2015－08－12修回］

［本文编辑：吴蓉］

［通讯作者］张晓杰，Email：251849753@qq.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.01.022

［中图分类号］R917：R331

［文献标志码］A