KPNA2基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵袭能力的影响

王涛　马思聪　戚星星　汤晓寅　崔丹　王智　池嘉昌　李萍　翟博

200127　上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤介入科



·论著·

KPNA2基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖和侵袭能力的影响

王涛马思聪戚星星汤晓寅崔丹王智池嘉昌李萍翟博

200127上海交通大学医学院附属仁济医院肿瘤介入科

【摘要】目的观察核转运蛋白基因α2(Karyopherin α-2，KPNA2)基因沉默对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及侵袭能力的影响。方法将KPNA2 siRNA干扰质粒用LipofectaminTM 2000方法瞬时转染人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404，转染后48 h应用蛋白质印迹法检测转染细胞中KPNA2蛋白表达。采用MTT法检测基因沉默细胞增殖能力，采用Transwell法检测基因沉默细胞侵袭能力。结果SMMC7721细胞株对照组mRNA为1.02±0.13，高于siRNA转染组的0.37±0.07(t=10.78，P<0.01)；肝癌Bel7404细胞株对照组mRNA为1.05±0.17，高于siRNA转染组的0.36±0.06 (t=9.38，P<0.01)。肝癌SMMC7721细胞株对照组蛋白定量值为0.96±0.10，高于转染组的0.42±0.05(t=11.83，P<0.01)；肝癌Bel7404细胞株对照组蛋白定量值为0.93±0.09，高于转染组的0.48±0.06(t=10.19，P<0.01)。SMMC7721和Bel7404细胞株在24、48和72 h时对照组增殖能力高于转染组，且差异有统计学意义(P<0.05)。SMMC7721细胞株对照组侵袭能力值为126.20±21.61，高于siRNA转染组的51.13±10.2 (t=7.68，P<0.01)；肝癌Bel7404细胞株对照组侵袭能力值为125.124±8.04，高于siRNA转染组的55.20 ±18.54 (t=8.48，P<0.01)。结论KPNA2基因沉默可以调节人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵袭能力。

【关键词】KPNA2；肝癌细胞株；SMMC7721；Bel7404；增殖能力；侵袭能力

核转运蛋白基因α 2(Karyopherin α 2，KPNA2)是核定位信号区域的一种结合蛋白，其作为核孔靶向复合物的组成部分，通过与核定位信号相结合的方式将蛋白质转运入核内发挥作用，从而达到调节相应基因表达的目的[1]。目前相关研究表明，KPNA2与细胞癌变密切相关，KPNA2基因沉默及过表达对人膀胱癌细胞株5637的增殖能力有调节作用[2]。然而，目前有关KPNA2基因与肝癌的相关性的研究较少，其确切分子机制尚不清楚。本研究通过采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404进行KPNA2基因沉默，探讨KPNA2基因干扰对肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404增殖以及转移能力的影响，以期为深入研究KPNA2基因在肝肿瘤中异常表达的分子机制提供新思路。

资料和方法

一、材料与试剂

人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404购自于美国菌种保藏中心。DMEM培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清培养基购自美国Hyclone公司。脂质体LipofectaminTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。质粒DNA提取纯化试剂盒购自美国TIANGEN公司。兔抗人多克隆抗体KPNA2和TNFRSF12A购自美国Abcam公司，兔抗人多克隆抗体GAPDH购自美国R&D Systems公司。PCR试剂盒购自美国Bio-Rad公司。细胞增殖活性测试MTT试剂盒购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量(WB)检测试剂盒购自美国TIANGEN公司。iRNA提取试剂盒购自美国TIANGEN公司。

二、试验方法

(一)靶向KPNA2干扰质粒的设计和合成根据GenBank中KPNA2基因序列(序列号：NM_002266)，使用小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)设计软件，并用BLAST工具确保其序列为特异性序列。设计合成的siRNA序列为：正义链5′-CCGUUGAUGAACCUCUUAATT-3′；反义链5′-UUAAGAGGUUCAUCAACGGTT-3′；同时设计一对阴性对照序列：正义链5′-UCCUCCGAACGU-GUCACGUTT-3′，反义链5′-ACGUGACACGUUC-GGAGAATT-3′。siRNA合成由上海吉玛制药技术有限公司化学合成。

(二)细胞培养将冷冻保存于液氮中的肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404复苏后，接种于含10%胎牛血清、DMEM培养基中，并加入100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素，然后置于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中进行培养。2～3 d进行1次培养基更换，当细胞铺满瓶壁约80%后，用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，接种于新的培养瓶中。

(三)分组和转染本试验设转染组和对照组，转染组采用KPNA2 siRNA干扰质粒进行转染，对照组采用无关序列RNA进行转染。每组细胞设6个平行复孔，每孔约1×106个细胞。放入CO2温箱内培养，当细胞生长融合铺满孔壁约至80%时，采用脂质体LipofectaminTM2000方法进行转染。转染时用无血清的DMEM 培养基，转染6 h后换成含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养48 h，其余转染过程按照说明书进行。

(四)RT-PCT的基因检测KPNA2引物上游5′- CTGCCCGTCTTCACAGATTCA -3′，引物下游5′- GCGGAGAAGTAGCATCATCAGG -3′；内参GAPDH引物上游5′- GAGCGAGATCCCTCCAA-AAT -3′， 内参引物下游5′- GGCTGTTGTCATAC-TTCTCATGG -3′。PCR扩增条件为[3]：94 ℃预变性5 min，然后再94 ℃变性40 s、63 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，总共30个循环，最后72 ℃延伸8 min。而后将PCR产物在3%的琼脂糖凝胶中电泳30 min后观察结果。

(五)蛋白质印迹法检测KPNA2蛋白表达将各组已转染的细胞加入蛋白裂解缓冲液中提取细胞总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。将总蛋白用8% SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移至NC膜上进行转膜，而后置于含5%脱脂奶粉的TBST封闭液中室温反应1 h，然后TBST洗2次，每次10 min。分别加入KPNA2一抗(1∶1000稀释)、内参GAPDH一抗(1∶1000稀释)维持4℃温育过夜。次日TBST洗膜3次，将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中作用1 h。暗室中ECL试剂盒显影观察结果。

(六)细胞增殖活性检测将细胞接种于96孔板中，每孔细胞浓度为1×105/mL，采用逆向转染的方法同步转染KPNA2及对照，然后分别于24、48和72 h每孔加入10 μL MTT(0.5 mg/mL)，37 ℃温育3 h后去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，并于37 ℃孵育10 min，中间取出摇晃1次，使结晶充分溶解。测定各孔吸光度值，计算6孔的平均值。

(七)细胞侵袭力检测将转染前后的5×104个肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404接种于上室，将20%的100 μL DMEM培养基置于Transwell小室的底室，细胞培养24 h后取出Transwell小室，此时细胞已迁移到膜的底面。对膜过滤的细胞用4%多聚甲醛溶液室温固定10 min，结晶紫染色5 min，光学显微镜下随机计数5个视野(×200)内迁移细胞的数量进行定量。

三、统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示。两组间的比较采用t检验；重复测量的资料采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、转染siRNA对KPNA2 mRNA水平的影响

结果显示，肝癌SMMC7721细胞中对照组和siRNA转染组mRNA分别为1.02±0.13和0.37±0.07；肝癌Bel7404细胞中对照组和siRNA转染组灰度比值分别为1.05±0.17和0.36±0.06。与阴性对照组比较，KPNA2 siRNA干扰质粒转染SMMC7721和Bel7404细胞后，转染组KPNA2 mRNA水平显著下降，且差异有统计学意义(t=10.78，P<0.01；t=9.38，P<0.01)。

二、转染siRNA对KPNA2蛋白表达水平的影响

结果显示，肝癌SMMC7721细胞中对照组和siRNA转染组灰度比值分别为0.96±0.10和0.42±0.05；肝癌Bel7404细胞中对照组和siRNA转染组灰度比值分别为0.93±0.09和0.48±0.06。与阴性对照组比较，KPNA2 siRNA干扰质粒转染SMMC7721和Bel7404细胞后，转染组KPNA2蛋白表达水平显著下降(图1)，差异有统计学意义(t=11.83，P<0.01；t=10.19，P<0.01)。

A. SMMC7721细胞株 B. Bel7404细胞株

三、转染siRNA质粒对增殖能力的影响

SMMC7721和Bel7404细胞株增殖能力结果显示，两细胞株的组别与时间存在交互作用(F=27.9，P<0.01；F=13.6，P<0.01)。SMMC7721和Bel7404细胞株增殖能力的两两比较结果显示，在24、48和72 h时对照组的吸光度值高于转染组的值，且差异有统计学意义(P<0.05)；与0 h的吸光度值相比，24、48和72 h两组均增高，且差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明SMMC7721和Bel7404细胞株转染组细胞增殖能力明显受到抑制，见表1，图2。

±s)

注：△表示与对照组比较P<0.05；▲表示与0 h比较P<0.05；*表示重复测量F检验P<0.05

图2　SMMC7721和Bel7404细胞株个时间点的增殖能力

四、转染siRNA质粒对侵袭能力的影响

SMMC7721和Bel7404细胞株侵袭能力结果显示，与对照组比较，转染组的侵袭能力值均低于对照组的值，且差异有统计学意义(t=7.68，P<0.01；t=8.48，P<0.01)。该结果表明SMMC7721和Bel7404细胞株转染后，其侵袭能力明显受到抑制，见表2。

±s)

讨论

KPNA2基因位于染色体17q23-q24，长度为1981 bp，编码产物是含529个氨基酸的核转运蛋白[4]。KPNA2是Karyopherin输入蛋白家族的成员，其主要作用是通过运载细胞质中的效应蛋白分子(如转录因子)穿过核膜进入细胞核，从而达到在核内调节效应基因或其他信号分子的表达[4]。KPNA2作为新近发现的一个候选癌基因，与其相关的研究主要集中在乳腺癌、食管癌、卵巢癌病理特征或预后关系[5-7]，而关于KPNA2基因在肿瘤中表达调控的机制研究较少。

研究发现，KPNA2基因沉默和过表达可以调节人膀胱癌细胞株5673的增殖能力[2]、迁移能力和侵袭能力[8]。KPNA2在肝癌组织中存在高表达，但在癌旁正常肝组织中低表达，且KPNA2的高表达与肝癌的分期、病理分级呈正相关[4, 9]；然而有关KPNA2基因沉默对肝癌细胞基因表达，增殖能力和侵袭能力的调节作用仍然不清楚。RNA干扰是目前一种常用的基因沉默技术，通过与外源或内源双链RNA相结合从而达到在生物体内诱导特异性基因沉默的目的[2]。本研究选用适度表达KPNA2的人肝癌SMMC7721和Bel7404细胞株作为细胞模型进行相关研究，并设计合成靶向siKPNA2干扰质粒，通过脂质体转染方法转染SMMC7721和Bel7404细胞。

本研究结果显示，与阴性对照组比较，siRNA转染的肝癌SMMC7721、Bel7404细胞株KPNA2的mRNA测量值和KPNA2蛋白表达水平显著下降，表明siRNA转染能达到有效抑制KPNA2和KPNA2蛋白表达水平。与阴性对照组比较， siRNA转染的肝癌SMMC7721、Bel7404细胞株增殖能力和侵袭能力均得到了有效抑制。大多数细胞内信号传导通路是通过细胞质中的一些效应分子进入细胞核，并调节效应基因或其他信号分子的表达实现的。较小的效应分子例如离子和相对分子质量<20～40×103的蛋白，能通过扩散作用直接穿过核孔复合物；而相对分子质量>40×103的蛋白要想穿过核膜进入细胞核，必须通过核孔复合物的转运才能通过核孔[2]。KPNA2就是其中一种运载蛋白，因此对人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404进行KPNA2基因沉默，能够抑制其运载效应分子进入细胞核进行调节效应基因和其他信号分子表达，从而达到抑制肝癌SMMC7721、Bel7404细胞株增殖和侵袭的能力的目的。

综合上述，通过RNAi技术沉默KPNA2可以调节人肝癌细胞株SMMC7721和Bel7404的增殖能力和侵袭能力。可以将KPNA2作为抑制肝癌生长和转移的期望靶点，通过抑制其基因表达，达到阻止肿瘤增殖和生长的目的。

参考文献

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4李凤, 蒲泽晏, 刘方久, 等. 核转运蛋白受体在肝癌中的表达水平研究. 国际检验医学杂志, 2014,15:2031-2032.

5Noetzel E, Rose M, Bornemann J, et al. Nuclear transport receptor karyopherin-alpha2 promotes malignant breast cancer phenotypes in vitro. Oncogene, 2012,16:2101-2114.

6He L, Ding H, Wang JH, et al. Overexpression of karyopherin 2 in human ovarian malignant germ cell tumor correlates with poor prognosis. PloS One, 2012,9:e42992.

7Ma S, Zhao X. Kpna2 is a promising biomarker candidate for esophageal squamous cell carcinoma and correlates with cell proliferation. Oncol Rep, 2014,4:1631-1637.

8史本涛, 苏博兴, 方冬, 等. Rnai沉默kpna2对人膀胱癌细胞系5637转移潜能的影响. 中华肿瘤防治杂志, 2015,11:832-835+845.

9李凤, 魏容, 刘方久, 等. 肝癌患者癌组织及癌旁正常组织kpna2检测及临床意义分析. 检验医学与临床, 2014,17:2425-2427.

(本文编辑：钱燕)

The impacts of KPNA2 gene silencing on the proliferation and invasion of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404WANGTao,MASi-cong,QIXing-xing,TANGXiao-yin,CUIDan,WANGZhi,CHIJia-chang,LIPing,ZHAIBo.DepartmentofInterventionalOncology,RenjiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the impacts of Karyopherin α-2 (KPNA2) gene silencing on proliferation and invasion of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404. MethodsHuman hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404 were transiently transfected with KPNA2 siRNA through adoption of LipofectaminTM 2000. Protein immunoblotting was performed to detect KPNA2 protein expression in transfected cells at 48 hours after transfection. MTT assay was carried out to assess proliferative capability of gene silencing cells, and Transwell assay was used to evaluate their invasion ability. ResultsRelative mRNA level of KPNA2 in control group of SMMC7721 and Bel7404 was higher than that in siRNA-transfected group (1.02±0.13 vs. 0.37±0.07, t=10.78, P<0.01; 1.05±0.1 vs. 70.36±0.06, t=9.38, P<0.01, respectively). Relative protein level in control group was higher than that in transfected group (0.96±0.10 vs. 0.42±0.05, t=11.83, P<0.01; 0.93±0.09 vs. 0.48±0.06, t=10.19, P<0.01, respectively). Proliferative capacity of control groups was stronger than that in transfected groups at 24h, 48h and 72h respectively, which revealed statistically significant differences (P<0.05). Invasive capacity in control group was more powerful than that in siRNA-transected group (126.20±21.61 vs. 51.13±10.2, t=7.68, P<0.01; 125.124±8.04 vs. 55.20 ±18.54, t=8.48, P<0.01, respectively ). ConclusionKPNA2 gene silencing could adjust the proliferative capacity and invasive ability of human hepatocarcinoma cell lines SMMC7721 and Bel7404.

【Key words】KPNA2; Hepatocarcinoma cell lines; SMMC7721; Bel7404; Proliferative capacity ; Invasion ability

(收稿日期：2015-09-15)

Corresponding author:ZHAI Bo, Email: zhaiboshi@sina.com

通信作者：翟博，Email：zhaiboshi@sina.com

基金项目：本项课题受国家自然科学基金(青年项目)资助(81201678)