miR-155在变应性鼻炎患者血清中的高表达

艾红辉，钟 伟，龙 平，吴英华，胡锦芳

(南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，南昌 330006)

miR-155在变应性鼻炎患者血清中的高表达

艾红辉，钟 伟，龙 平，吴英华，胡锦芳

(南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，南昌 330006)

目的 探讨miR-155在变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者外周血清中的表达。方法 分别提取变应性鼻炎及健康人群外周血清中总RNA并进行质检;应用实时荧光定量PCR技术检测验证变应性鼻炎患者外周血清中miR-155与正常对照者的表达差异。结果 AR患者外周血中细胞总数及嗜酸性粒细胞数高于正常对照组，血清中miR-155显著高于正常对照组，是正常对照组的2.1倍。结论 miR-155在AR患者血清中为高表达。

变应性鼻炎; miRNA-155； 血清； 高表达

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻喉科的常见病和多发病,其典型临床表现为反复发作的鼻痒、喷嚏及清水样涕，是一种全身免疫紊乱在上呼吸道的表现。保守估计全球的AR患者超过5亿[1]，我国也早在2004年就进行AR流行状况的多中心调查[2],发病率高达20%[3]。本病的关键在于Th2>Thl的免疫反应，此病易治疗难控制。近年来，MicroRNA在变应性鼻炎发生发展中的作用已日益受到关注。在众多miRNA当中，microRNA-155是免疫系统最主要的miRNA之一，在活化的各种免疫细胞中表达普遍升高，广泛参与固有免疫应答和适应性免疫应答。

本文通过检测AR中血清miRNA-155的表达情况，分析求证在AR发病过程中miRNA在血清中的特异性表达，探讨其可能的诊断和预后的靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年1至2013年1月南昌大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科接诊的AR患者(AR组)22例，年龄16～40岁，其中男15例，女7例，平均年龄21.5岁。均符合2009年福建武夷山制定的《变应性鼻炎诊断和治疗指南》的标准确诊[4]，为持续性变应性鼻炎，症状为中-重度，皮肤点刺试验中仅屋尘螨()，且不伴有鼻窦炎、哮喘及阿司匹林耐受不良等疾病，最近3个月内未接受全身或局部糖皮质激素治疗，未经抗组胺和免疫治疗。同时选择在本科要求体检年龄、性别相当健康人22例作为对照组，男13例，女9例，平均年龄19.08岁，皮肤点刺试验全部阴性。所有受试者均需常规检查取血，在征求知情同意后入组备血，并签署知情同意书，报由南昌大学第一附属医院伦理委员会批准。全部患者均采取肘静脉取血。

1.2 标本收集与检测方法

1.2.1 标本采集与处理

所有入组人员常规检测血压，查血常规，C反应蛋白，嗜酸性粒细胞；同时备血通过2次离心获得无细胞血清，简言之：离心得上层血清后，在取血30 min 内以1500 r·min-1离心10 min，取上层血清于-80 ℃ 冰箱保存备用。

1.2.2 血清总RNA的提取与质检

采用美国Qiagen公司试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit)并参照说明书分别提取变应性鼻炎组与对照组的总RNA。紫外分光光度计分别测定波长230、260和280 nm的吸光度(A)值，确定样品总RNA的纯度和浓度；甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测样品总RNA中28 s和18 s的比例，评估RNA纯度及完整性。

1.2.3 实时荧光定量PCR

使用美国Qjagen公司试剂盒fmiScript SYBR Green PCR Kit)，根据说明书进行。验证变应性鼻炎患者与对照者中miR-155的表达[5]。

取总RNA各1 μg进行反转录。RT引物序列:miR-155，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’。RT反应程序:16 ℃ 30 min,42 ℃ 42 min，85 ℃5 min。实时定量PCR反应体系:反转录产物1 μL，dNT P(2.5 mmol) 21 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，MgCl2溶液1.5 μL,T aq聚合酶1 U，SYBER greenⅠ终浓度0.25×10 μmol的PCR特异引物(miR-574-5p：5’-GGGGGTGAGTGTGTGTGTGT-3’，5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’)1 μL，加水至总体积为25 μL。Realt imePCR仪进行检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 样品总RNA质量鉴定

血清中提取的总RNA纯度高，蛋白质和DNA污染少，总RNA中各条带清晰，无明显降解现象(封四图1)。质量鉴定结果表明各样品总RNA质量符合miRNA微阵列要求，可以进行后续芯片实验。

2.2 AR组外周血气道炎症明显高于正常对照组

AR组外周血中嗜酸粒细胞增多，符合变应性鼻炎特征表现(封四图2，P<0.05,n=22)。

2.3 AR组血清miRNA-155显著高于正常对照组

Real-time PCR法检测AR组血清miRNA-155的表达，结果显示:符合变应性鼻炎症状体征、皮肤过敏原点刺试验阳性的AR患者，血清miRNA-155表达量约为正常对照组的2.1倍(封四图3，P<0.05,n=22)。

2.4 miR-155与炎症指标的相关分析

血清miRNA-155表达水平与临床炎症指标EO%呈正相关(封四图4，r=0.346，P<0.01)。进一步进行线性逐步回归分析，结果显示EO%与miRNA-155水平呈独立正相关(r=2.968.847，P=0.440，P=0.001)。

3 讨论

微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)是一类在转录后基因调控中发挥功能的非编码小RNAs,在发育、生长的分化等过程中发挥重要作用。miRNA可以通过降解mRNA或抑制蛋白翻译的方式调节特异基因表达。无论是健康人或者患者血清中都存在大量的miRNA,都有特异性表达。由于外周血的获得越来越简单，能在血液中检出特异性的miRNA并将其作为变应性鼻炎的生物学标志具有更广泛的意义。

血清miRNA在过敏性鼻炎中的功能和表达研究相对较少。Shao等[6]研究发现，在过敏性鼻炎患者鼻黏膜中有9个miRNAs发生两倍以上的变化，经验证发现miR-143、miR-187和miR-224表达水平降低。本研究通过比较变应性鼻炎患者与健康试验者血清miR-155的表达情况，提示miR-155在变应性鼻炎中的高表达，可能miR-155是参与变应性鼻炎发病的miRNA,这对AR患者个性化的诊断、治疗，具有良好的前景及潜在性价值。

[1] Bousquet J,Khaltaev N,Cruz A A,et al.Allergic rhinitis and its impact on asthma(ARIA)2008 update(in collaboration with the world health organization，GA2LEN and AllerG-en)[J].Allergy,2008,63:8-160.

[2] 韩德民，张罗，黄丹，等.我国11个城市变应性鼻炎自报患病率调查[J].中华耳鼻咽喉头颈外科学杂志,2007,42(5):378-384.

[3] Zhao J,Bai J,Shen K,et al.Self-reported prevalence of childhood allergic diseases in three cities of China:a multicenter study[J].BMC Public Health，2010,10:551.

[4] 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志编委会.变应性鼻炎诊断和治疗指南(2009 年，武夷山)[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2009，44(12):977-978.

[5] 揭伟，王晓燕，罗泊涛，等.应用微阵列芯片分析不同分化鼻咽癌细胞株miRNA 的表达[J].华中科技大学学报:医学版,2010,6(39):336-341.

[6] Shao Q Y，Ru X Z，Guo J L，et al.Microarray analysis of differentially expressed microRNAs in allergic rhinitis[J].Am J Rhinol Allergy，2011，25(6):e242-e246.

(责任编辑：刘大仁)

High Expression of miRNA-155 in Serum of Patients with Allergic Rhinitis

AI Hong-hui,ZHONG Wei,LONG Ping,WU Ying-hua,HU Jin-fang

(DepartmentOtolaryngologyHeadandNeckSurgeryoftheFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China)

Objective To investigate the expression of microRNA-155 (miR-155) in serum of patients with allergic rhinitis.Methods Total RNA was extracted from the serum of allergic rhinitis patients and healthy subjects,and the expression of miR-155 was detected by real-time quantitative PCR.Results The total number of cells and the number of eosinophils in peripheral blood in allergic rhinitis patients were higher than those in healthy subjects.Moreover,serum expression of miR-155 in allergic rhinitis patients was 2.1 times as high as that in healthy subjects.Conclusion The miRNA-155 is highly expressed in serum of patients with allergic rhinitis.

allergic rhinitis; miRNA-155; serum; high expression

2016-08-20

江西省科技厅2011年计划课题(20112BBG70046)

艾红辉(1966—)，女，硕士，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉科疾病的临床研究。

R765.21

A

1009-8194(2016)11-0064-02

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.11.026