4-氨基吡啶抑制肺癌细胞SPCA1及PC9增殖及其分子机理的研究

甄艳，黎东明,2，黄玉洁,2，谷红丽,2，吴斌,2

(广东医科大学 附属医院 1.呼吸疾病研究所; 2.呼吸内科，广东 湛江 524001)



4-氨基吡啶抑制肺癌细胞SPCA1及PC9增殖及其分子机理的研究

甄艳1，黎东明1,2，黄玉洁1,2，谷红丽1,2，吴斌1,2

(广东医科大学 附属医院 1.呼吸疾病研究所; 2.呼吸内科，广东 湛江 524001)

目的 探讨4-氨基吡啶(4-AP)对肺癌细胞增殖的影响及分子机制。方法 浓度为0、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 mmol/L的4-AP分别处理SPCA1和PC9细胞48 h，MTT法测定4-AP对肺癌细胞的抑制率及IC50。浓度为0、4.7或0、6.25 mmol/L的4-AP分别处理SPCA1和PC9细胞0、24、48、72 h或14 d或48 h，MTT法测定肺癌细胞的增殖率或平板克隆形成实验测定肺癌细胞的增殖或流式细胞仪检测细胞周期。浓度为0、3、4.7或0、3.125、6.25 mmol/L的4-AP分别处理SPCA1和PC9细胞48 h，利用Western blot检测PI3K/AKT信号通路和细胞周期相关蛋白。结果 MTT结果显示，4-AP 浓度越高，对肺癌细胞增殖的抑制越强，SPCA1和PC9细胞的IC50分别为4.7 mmol/L和6.25 mmol/L。MTT法显示，4-AP组细胞生长速度减慢(P<0.01)。平板克隆结果显示，与对照组相比，4-AP组细胞平板克隆小且数量少(P<0.05)。流式细胞仪检测细胞周期显示，4-AP组细胞G1期比例增多(P<0.05)。Western blot结果显示，与对照组相比，4-AP组细胞中，P21表达上调，p-PI3K (Tyr458)、p-AKT (Ser473)、CCND1和CDK4表达下调，PI3K和AKT表达不变。结论 4-AP抑制肺癌细胞生长，且4-AP可能通过调控PI3K/AKT信号通路及下游细胞周期相关蛋白的表达。

4-氨基吡啶; 非小细胞肺癌；生长

近年来肺癌已经成为大多数国家恶性肿瘤死亡的首要原因[1]，5年总体生存率仅为10%左右[2]。手术治疗被认为是早中期最有效的治疗方法，但由于肺癌早期症状大多无特异性，临床上大部分患者就诊时已确诊肺癌晚期，错过手术的最佳时期。化疗作为辅助治疗手段或晚期肺癌的主要治疗方法，仍然是不可缺少的手段。因此，寻找有效的化疗药物成为恶性肿瘤治疗研究的热点之一。

4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)，是一个常用的K+通道阻滞剂，在多种恶性肿瘤中抑制细胞增殖，包括肝癌[3]、急性髓系白血病[4]和神经胶质瘤[5]等。因此，4-AP可以看作是一个治疗恶性肿瘤的潜在药物。本研究采用不同浓度的4-AP与肺癌细胞体外共培养，然后通过MTT法、平板克隆形成实验和流式细胞仪检测细胞周期，探讨4-AP对肺癌细胞增殖的影响，同时检测细胞中PI3K/AKT信号通路及下游细胞周期相关蛋白的变化，为4-AP抗癌作用及其机理研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌细胞株 SPCA1、PC9均由南方医科大学肿瘤研究所方唯意教授馈赠，培养基是含10%(φ)胎牛血清的DMEM，在37 ℃、5%(φ)CO2、饱和湿度的条件下传代培养，细胞生长状态良好时用于实验。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基(HyClone公司)；胎牛血清(BI公司)；0.25%胰酶(吉诺生物)；4×SDS上样缓冲液(TAKARA公司)； MTT、DMSO、4-AP (Sigma公司)；细胞周期检测试剂盒(碧云天)；磷酸酶抑制剂(申能博彩)；蛋白Marker(Fermantas公司)；RIPA、PMSF蛋白裂解液及增强型化学发光检测试剂盒(碧云天)； CCND1、p-PI3K (Tyr458)、p-AKT(Ser473)、PI3K、AKT、CCND1、CDK4和P21抗体及HRP标记的抗鼠、抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗体(Proteintech公司)。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱(Thermo公司)；超净工作台(苏净集团安泰公司)；流式细胞仪(BD公司)；Model 680酶标仪、垂直凝胶电泳系统及蛋白质转膜、高灵敏度化学发光成像系统(Bio-Rad公司)。

1.2 MTT实验检测4-AP对肺癌细胞增殖的影响

按5 000个/孔接种细胞于96孔板中，每组5个复孔，每孔体积200 μL，同时设空白对照(仅加培养基)。待细胞贴壁后，弃掉孔内原培养液，加入4-AP至终浓度为0、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 mmol/L，培养48 h。或加入4-AP至终浓度为0、4.7或0、6.25 mmol/L，培养0、24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃继续培养4 h后弃孔内培养基，加入DMSO 150 μL，室温避光摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，用酶标仪(λ=490 nm)测定各孔吸光度值(A值)，以相应的A值表示细胞生长能力。各组取平均值，重复3次，绘制生长曲线。

1.3 平板克隆形成实验检测4-AP对肺癌细胞生长的影响

取状态良好的细胞，制备成单细胞悬液，于6孔板中按照每孔100个细胞接种，每组设2个复孔，待细胞贴壁后，加入4-AP至终浓度为0、4.7或0、6.25 mmol/L，5%CO237 ℃孵箱培养约14 d，至肉眼清晰可辨的细胞克隆形成，弃培基，D-hanks清洗3次，空气干燥；甲醇固定10 min后，弃甲醇空气干燥；用苏木素染色5 min，流水缓慢吸取染液，空气干燥后计数形成的克隆数(≥50个细胞为1个克隆)。实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测4-AP对肺癌细胞周期的影响

将状态良好的细胞接种于6孔板中，每组2个复孔。待细胞汇合度达60%时，弃掉孔内原培养液，加入4-AP至终浓度为0、4.7或0、6.25 mmol/L，培养48 h；胰酶处理使细胞分散，用PBS离心洗涤细胞2次，弃上清，加入1 mL 70%(φ)冰乙醇混匀，固定待用，4 ℃可保存1周，-20 ℃可保存1月；PBS洗涤离心细胞1次，加入500 mL PBS，25 μL PI(5 ng/mL)及5 μL RNase A染色30 min；冰上避光15 min，上机检测。

1.5 Western blot检测PI3K/AKT信号通路及细胞周期相关蛋白的变化

制胶。取30 μg蛋白质，用4×SDS上样缓冲液按3∶1体积比混合，95 ℃水浴变性，加样，电泳，转膜，室温摇床孵育1 h(含3% BSA的TBST溶液)。弃封闭液，分别加入目的蛋白的抗体(1∶1 000)及β-actin鼠抗人单克隆抗体(1∶1 000)，室温摇床孵育1 h，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜5 min×3次，然后分别按照1∶1 000的比例加入抗兔或抗鼠二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。ECL化学发光检测与曝光。用Image Lab软件进行数据处理和分析。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 4-AP对肺癌细胞SPCA1和PC9的IC50

4-AP对肺癌细胞的抑制作用呈浓度依赖关系，SPCA1和PC9细胞的IC50分别为4.7 mmol/L和6.25 mmol/L(图1)。

图1 SPCA1和PC9细胞经不同浓度4-AP处理后的存活率

Figure 1 Effect of 4-AP on the viability of SPCA1 and PC9 cells

2.2 4-AP对肺癌SPCA1和PC9细胞增殖的影响

与control(不加4-AP细胞)相比，4-AP组细胞生长减慢，差异有统计学意义(SPCA1F=330.062,P<0.01；PC9F=3 491.852,P<0.01)(图2)。

2.3 4-AP对肺癌SPCA1和PC9细胞克隆形成能力的影响

与control相比，4-AP组细胞平板克隆小且数量少，差异有统计学意义(SPCA1t=5.031，P=0.007；PC9t=6.647，P=0.003)(图3)。

2.4 4-AP对肺癌SPCA1和PC9细胞周期的影响

与control相比，4-AP组G1期细胞比例增多，S期细胞比例减少，差异有统计学意义(G1∶SPCA1t=-5.373,P=0.006；PC9t=-6.687，P=0.003；S∶SPCA1t=6.916 ，P=0.002；PC9t=5.847，P=0.004)(图4)。

图2 4-AP处理SPCA1和PC9细胞的生长曲线

Figure 2 Effect of 4-AP on the growth curves of SPCA1 and PC9 cells

图3 4-AP对SPCA1和PC9细胞平板克隆形成能力的影响

Figure 3 Effect of 4-AP on the colony formation of SPCA1 and PC9 cells

图4 流式细胞术检测4-AP对SPCA1和PC9细胞周期的影响
Figure 4 Effect of 4-AP on the cell cycle of SPCA1 and PC9 cells

2.5 4-AP对肺癌细胞SPCA1和PC9的PI3K/AKT信号通路及下游细胞周期相关蛋白的影响

以β-actin为内参，结果显示∶与control相比，4-AP组细胞中，P21表达上调，p-PI3K (Tyr458)、p-AKT(Ser473)、CCND1和CDK4表达下调，PI3K和AKT表达不变(图5)。

1. SPCA1-Ctr; 2. SPCA1-3 mmol/L; 3. SPCA1-4 mmol/L; 4. PC9-Ctr; 5. PC9-3.125 mmol/L; 6. PC9-6.25 mmol/L。

图5 Western blot检测4-AP处理SPCA1和PC9后p-PI3K (Tyr458)、p-AKT (Ser473)、PI3K、AKT、CCND1、P21和CDK4蛋白的表达水平

Figure 5 Effect of 4-AP on the expression of p-PI3K (Tyr458),p-AKT (Ser473),PI3K,AKT,CCND1,P21 and CDK4 in SPCA1 and PC9 cells

3 讨论

4-AP是一个常用的K+通道阻滞剂，抑制多种恶性肿瘤细胞增殖[3-5]，但是其在肺癌中功能及具体的分子机制目前还不清楚。本研究发现4-AP可能通过调控PI3K/AKT信号通路及其下游细胞周期相关蛋白的变化，抑制肺癌细胞生长，并且抑制细胞周期G1期到S期转化。

PI3K/AKT是一条经典的信号传导通路，通过影响下游多种效应分子的活化状态，可以抑制细胞凋亡和促进细胞周期进程，与人类多种肿瘤的发生发展密切相关[6-8]。本研究发现4-AP抑制肺癌细胞生长，Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白，发现p-PI3K (Tyr458)和p-AKT (Ser473)表达下调，PI3K和AKT表达不变，提示4-AP可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制细胞生长。

细胞周期失控可导致细胞增殖异常，是肿瘤发生发展的重要环节。在细胞周期中存在G1/S转换点(R点)，细胞一旦通过了此限制点，将会自主的完成增殖周期[9]。因此对于调控细胞周期进展关键基因及G1/S转换的研究，将有助于揭示肿瘤的发生发展过程。参与调控细胞周期的主要分子有∶细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)。cyclin是细胞周期核心因子，在G1/S转换中CCND1起重要作用，在受到外源增殖信号刺激时，其表达明显上调，cyclin与CDK组成复合体，引导细胞从G1期通过R点，细胞周期将自主进行。CKI能够负性调节cyclin-CDK组成复合体[10]，可阻止细胞通过R点。本研究发现4-AP抑制肺癌细胞增殖，并且抑制细胞周期G1期到S期转化，Western blot检测细胞周期相关蛋白表达，发现CCND1和CDK4表达下调，起负调控作用的P21表达上调，提示4-AP可能通过下调CCND1和CDK4的表达且上调P21的表达导致细胞通过G1/S期R点受阻，抑制细胞生长。

基于上述的研究结果，明确4-AP通过调控PI3K/AKT信号通路及下游细胞周期相关蛋白抑制NSCLC细胞生长，为非小细胞肺癌的治疗提供一些新的思路。

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(责任编辑：幸建华)

Inhibition of 4-aminopyridine on cell growth of lung cancer SPCA1 and PC9 cells and its molecular mechanism

ZHEN Yan1,LI Dongming1,2,HUANG Yujie1,2,GU Hongli1,2,WU Bin1,2

(1.InstituteofRespiratoryDiseases,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

Objective To explore the effect and molecular mechanism of 4-aminopyridine (4-AP) on the proliferation of human lung cancer cells. Methods SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,0.195,0.39,0.78,1.56,3.125,6.25,12.5 and 25 mmol/L) for 48 h and then MTT method was used to determine the inhibition rate of lung carcinoma cells and IC50. SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,4.7 or 0,6.25 mmol/L) for 0,24,48,72 h or 14 d or 48 h,respectively,and then MTT method,colony formation assay and FACS cytometry assay were adopted for detection of the proliferation,growth and cell cycle of lung carcinoma cells.SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,3,4.7 or 0,3.125,6.25 mmol/L) for 48 h,and western blot was used to examine the expression of PI3K/AKT signaling and cell cycle-associated proteins. Results IC50s of 4-AP on SPCA1 and PC9 cells were 4.7 mmol/L and 6.25 mmol/L,respectively.Treatment with 4-AP significantly inhibited the cell growth (P<0.01) and proliferation (P<0.05) of SPCA1 and PC9 cells.4-AP blocked cell cycle transition from G1 to S and G2 phase in PC9 and SPCA1 cells (P<0.05).Meantime,4-AP increased the expression of P21 and decreased the expression of p-PI3K (Tyr458),p-AKT (Ser473),CCND1 and CDK4,whereas total protein levels of PI3K and AKT remained unchanged. Conclusion 4-AP inhibits the proliferation of lung carcinoma cells by modulation of the PI3K/AKT signaling and downstream cell cycle-associated proteins.

4-AP; NSCLC; growth

2016-06-27

国家自然科学基金项目(81401906);广东医科大学附院博士基金(BJ20150003)

甄艳(1984—)，女，博士，助理研究员，Email：yingshuang288@163.com，主要从事肺癌发病机制研究；通信作者：吴斌(1962—)，女，教授，硕士生导师，主要从事呼吸疾病研究，Email：wubin621011@126.com。

时间：2016-09-30 10:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1022.004.html

R734.2

A

1006-8783(2016)05-0613-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062701