新型诊断标志物循环miRNA的研究进展与应用

何顺伟综述，魏晓星，2＊审校

(1.青海大学生态环境工程学院；2.青海大学医学院基础医学部，青海 西宁 810016 )

新型诊断标志物循环miRNA的研究进展与应用

何顺伟1综述，魏晓星1，2＊审校

(1.青海大学生态环境工程学院；2.青海大学医学院基础医学部，青海 西宁 810016 )

循环miRNA是一类在血清、血浆等体液中稳定存在的miRNA分子，具有差异表达明显、检测灵敏、取材方便等特点。循环miRNA可作为一种新型诊断标志物分子，在癌症预测、产前诊断、损伤及感染检测等多个方面有临床应用前景。本文即对循环miRNA的来源和功能、诊断标志物潜能及临床应用前景等方面的研究进展作一综述，并对目前应用中 存在的相关问题进行探讨。

1 循环miRNA概述

MiRNA是一类长度约为18-24 nt左右的内源性单链非编码小分子RNA，它与mRNA的3′ UTR互补结合致mRNA直接降解或抑制其翻译而干扰蛋白质的合成，主要在转录后水平调节基因的表达。自1993年被发现以来[1]，miRNA独特的分子结构和功能成为世界关注的焦点，开辟了分子生物学研究的一个新领域。

miRNA在进化上具有极高的保守性、时序性、组织特异性及稳定性等特点。研究表明在血清、血浆等体液中能够检测到稳定存在的miRNA，即循环miRNA[2，3]。循环miRNA在不同生理病理条件下表达水平差异明显，与个体的健康水平密切相关[4～6]。随着分子生物学技术的发展，循环miRNA的检测手段日渐趋于成熟，灵敏度高且操作损伤小，有广阔临床应用前景。

2 循环miRNA的来源和功能

2.1 细胞内miRNA的产生和作用机制

细胞内miRNA的产生过程同蛋白编码基因的转录过程十分相似。首先，miRNA基因在RNA聚合酶II或III作用下转录形成初级miRNA(pri-miRNA)，pri-miRNA长度从200 nt到数千nt不等，经修饰加工后形成含有5′ cap和3′ poly A尾的特征性发卡结构。然后，pri-miRNA被Drosha-DGCR8复合体切割成约70 nt的发卡状miRNA前体(pre-miRNA)，继而经exportin-5等蛋白转运到细胞质中。最后，pre-miRNA被Dicer酶剪切成约22 nt的miRNA： miRNA*双链，其中一条成熟的单链miRNA与Argonaute蛋白等结合被引导进入RNA诱导沉默复合体(RISC)中，另一条单链miRNA*被降解(图1)。

成熟的单链miRNA经碱基互补靶向结合到mRNA的3′ UTR，通过直接降解mRNA或抑制其翻译来调控基因的表达。资料显示[7]，miRNA与其靶基因mRNA的碱基互补程度将决定mRNA是降解还是抑制：当二者完全互补时直接降解mRNA，多发于植物中；当二者不完全互补时将抑制靶基因蛋白翻译，多发于动物中。作为一种表达调控因子，miRNA能够靶向调控大约60%的蛋白编码基因[8]，且在细胞增殖、分化、凋亡、免疫、炎症等多种生理病理调控过程中起核心作用[9]。miRNA异常表达、加工或突变同样会使与之相关的靶基因活性改变而影响正常的基因功能，进而造成癌症、心脏病、糖尿病等多种疾病发生[10]。miRNA的产生和作用机制如图1所示。

2.2 循环miRNA的来源和功能

关于循环miRNA的来源存在较大争议，目前主要有两种观点。第一，miRNA从受损或凋亡的细胞中被动渗出进入体液循环，如miRNA-208在心脏中特异性表达，当发生心肌梗死时可在血浆中检测到[11]。第二，miRNA通过两种方式主动分泌进入体液循环(图1)，一种是与高密度脂蛋白(HDL)、核酸蛋白1(NPM1)以及家族蛋白2(Ago2)等特异结合分泌至细胞外；另一种则是miRNA被包装在微体(microvesicle)或外来体(exosomes)等活性囊泡中分泌至细胞外。有学者发现[12]，miRNA的分泌需要神经酰胺的参与，而神经酰胺的合成受到神经磷脂酶2(nSMase2)控制。

Pol II：RNA聚合酶；Drosha/DGCR8：RNase III酶；Exportin-5：蛋白转运体；Dicer：剪切酶；Pri-miRNA：初级miRNA；Pre-miRNA：前体miRNA；RISC：RNA诱导沉默复合体；exosomes：活性囊泡；Ceramide：神经酰胺

图1 miRNA的产生和作用机制示意图

Figure 1 Biogenesis and mechanism of miRNA

对循环miRNA的功能研究尚处于起步阶段，其中最引人注目的就是循环miRNA参与细胞间的信息交流。即miRNA可从某一细胞产生、释放至体液后被另一细胞识别、摄取和利用，最终实现细胞间信息交流。Zhang等发现[13]，微血管内皮瘤细胞-1能够摄取体内血细胞或体外培养的人单核细胞分泌的循环miRNA-150调节原癌基因c-Myb的表达。Pegtel等[14]通过体外共培养实验证实B细胞感染EB病毒后分泌的miRNA，可被外周血单核细胞摄取并抑制相应的EB靶基因表达。此外，循环miRNA还被发现具备一些特殊功能，如调控肿瘤发生和免疫反应，参与造血和细胞分化等。

3 循环miRNA的诊断标志物潜能

由于传统蛋白类生物标志物成分复杂，存在翻译后修饰及低灵敏度、低丰度和低特异性等不足，限制了其临床应用。近年人们发现循环miRNA具备稳定性好、表达差异明显、检测灵敏以及能及时反映人体状况等特征，是一类潜在的新型诊断标志物分子。

3.1 循环miRNA的稳定性

鉴于体液中含有丰富的RNase，所以学界普遍认为体液中的miRNA是极不稳定的。而有研究发现，循环miRNA在RNase作用、多次冻融、煮沸、极端pH和温度等状况下并未发生显著性变化[3]。进一步实验显示，循环miRNA大多不是以游离形式存在的，而是与特殊蛋白结合[15]或包裹在活性囊泡中[16]以复合体的形式存在于体液中，因而具备了抗RNase降解的能力，能够稳定保存。这一特性为循环miRNA发挥生物学功能提供了前提保证，也为其作为生物标志物提供了可能。

3.2 循环miRNA的表达差异

循环miRNA已被多次证实在不同生理病理条件下具有明显的表达差异，与个体的生理病理状态密切相关。例如，Gilad等[17]对比怀孕妇女与未孕妇女血清的miRNA发现，血清miR-526a和miR-527在孕期显著表达并随着妊娠周数增加而升高。并且Chim等[18]实验显示，血浆miRNA-141和miRNA-149在孕妇产后表达水平显著性下降。此外，不同健康个体的循环miRNA表达水平没有显著差异，而疾病能够明显影响循环miRNA的表达，并且随病情进展其表达谱呈现动态变化。如循环miR-122在肝脏病变中显著表达[4]，循环miR-125在肺部病变中显著表达[5]，循环miR-483在胰腺病变中显著表达[6]。这些差异表达的循环miRNA既是其功能研究的基础，又是潜在的诊断标志物分子。

3.3 循环miRNA的检测方法

由于循环miRNA片段小、表达量低，使其定量检测受到限制。尽管如此，近年来仍发展了多种有效的循环miRNA检测方法[19，20]，不仅包括传统的cDNA文库克隆法和Northern blot、qRT-PCR法，还包括新近发展起来的基因芯片技术、高通量测序技术。其中cDNA文库克隆法是发现新miRNA分子的首选方法，大部分已知的miRNA都是通过cDNA文库克隆发现和鉴定的。Northern blot法是验证和确认循环miRNA的重要方法。qRT-PCR法是循环miRNA定量检测最常用的有效方法，可以精确地定量分析样本中微量miRNA的表达。基因芯片技术可以实现快速、高通量的miRNA表达分析。高通量测序技术是目前最具前景的检测循环miRNA的技术，可以用于检测miRNA组织特异性和时序特异性表达。我们可以根据自己的研究目的选择适合的检测方法。随着分子生物学技术的发展，循环miRNA的检测手段又有了新的改进和发展，如锁核酸(LNA)探针法、Stem loop RT-PCR法、纳米金标记法和滚环扩增法等[21]使循环miRNA的检测具有更高的灵敏度和精确度，为其成为诊断标志物提供技术支持。

4 循环miRNA的应用前景

4.1 循环miRNA作为癌症标志物

循环miRNA的表达水平与癌症的发生和演进密切相关，具备类似致癌基因或抑癌基因的作用，并且不同癌症类型具有特定的表达谱。最早由Lawri等[22]报道，弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中miRNA-155、miRNA-210和miRNA-21表达水平较正常对照明显升高，可作为弥漫性大B细胞淋巴瘤的诊断标志物。之后关于循环miRNA作为结直肠癌、肝癌、肺癌、白血病等癌症标志物的研究屡见报道。对循环miRNA作为癌症标志物的相关研究进行如下总结(表1)。

表1 循环miRNA作为癌症标志物

Table 1 Circulating miRNA as diagnostic markers for different human cancer

注：“↑”：miRNA表达上调；“↓”：miRNA表达下调.

4.2 循环miRNA作为产前诊断标志物

目前，产前诊断通常依靠侵入性检测手段，风险较高，母体血浆中miRNA的发现为非侵入性的产前诊断开创了可能，并且稳定性好、特异度高。近年来，Zahm等[29]证实，循环miR-200b/429水平可作为婴儿胆道闭锁的诊断指标。Zhu等[30]通过Solid测序和qRT-PCR等证实，miRNA-196、miRNA-22、miRNA-29c和miR-375在行孕期先天性心脏病检测的孕妇的血清中表达上调，可作为产前先天性心脏病的诊断指标。Lalevee等[31]证实，在先兆子痫孕妇胎盘中miR-455-3p和miR455-5p表达显著性下调，在孕妇血液中检测到miR-455，表明循环miR-455可作为孕妇先兆子痫的诊断指标。

4.3 循环miRNA作为损伤标志物

循环miRNA-122已证实在药物、病毒、酒精和化学诱导的肝损伤中表达上调。Huang[4]等在胆道梗阻诱导的胆汁淤积肝损伤的小鼠中发现血清miRNA-122表达显著升高。因此，循环miRNA-122具有肝损伤诊断价值。另外，在急性肾缺血损伤的小鼠血浆中miR-714、miR-1188、miR-1897-3p、miR-877*和miR-1224的表达水平显著高于对照组，且miR-1897-3p和Nucks1基因表达紧密相关[32]。急性脊髓损伤的小鼠血浆中miR-219、miR-384-5p和miR-9*在损伤12 h后表达水平显著升高，并同损伤程度相关[33]。这些结果表明，循环miRNA具备作为组织损伤诊断标志物的潜能。

4.4 循环miRNA作为感染标志物

循环miRNA在感染性疾病宿主和病原体的相互作用过程中发挥重要作用，在病原体感染进程中循环miRNA表达谱呈现特征性改变，可以作为筛选和诊断感染性疾病的标志物。如HBV病人肝纤维化病变过程中有12种血浆miRNA差异表达明显，其中10个上调，2个下调[34]。HCV患者血浆miRNA中miR-122、miR-134、miR-424-3p和miR-629-5p表达明显上调[35]。Morán等[36]研究甲型H1N1流感病毒A(A/H1N1)轻、重型患者及同居者和健康者的循环miRNA表达谱时发现，miR-150、miR-29c、miR-145、miR-22和miR-150在重型患者中呈差异性表达，其中miR-150较轻型患者显著性过表达，而miR-210、miR-126和miR-222在同居者中表达水平下降。

5 存在问题及展望

开发循环miRNA作为诊断标记物具有重要的理论和实践意义，但目前仍然存在以下几个问题需要我们去解决。1、体液miRNA浓度低分离提取繁琐，费用高，加上可能存在mRNA降解或其他小RNA的干扰，使获取的miRNA的质量难以保证。2、缺乏统一准确的循环miRNA检测方法，目前不同检测miRNA的手段都存在各自的局限，如对于部分丰度较低且具有组织和时序特异性的miRNA分子而言，很难构建其cDNA文库；Northern blot方法繁琐并且灵敏度较低，不适用于临床样本的高通量检测；qRT-PCR实验结果很大程度上依赖于引物和探针的设计；基因芯片技术准确性和可重复性较差，要求初始样本量大；高通量测序技术价格昂贵且操作费时。3、目前对循环miRNA作为诊断标志物的研究尚处于探索阶段，研究的病种还不全面，所检测的病例数也有限，筛选出的可能作为诊断标志物的循环 miRNA的灵敏性和特异性尚需要进一步实验验证。4、最重要的是循环miRNA的产生和作用机制仍不清楚，不同生理病理条件下循环miRNA参考值范围尚未确定。

对循环miRNA的研究已经成为当今医学领域的热点，可以预期这种趋势将继续延续。循环miRNA作为诊断标志物，将改变和补充对疾病发生发展的传统认识，同时整合基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和系统生物学等相关研究的知识，从全方位阐明多种疾病产生和发展的分子机制，使疾病检测手段更加丰富和有效。相信随着循环miRNA生成机理、生物学功能以及检测手段逐步被阐明和标准化，其在未来的无创诊断中将展示出广阔的应用前景。

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*：国家自然科学基金项目(31260015) 何顺伟(1988～)，女，汉族，河南信阳，在读硕士研究生

R446.11

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.012

2015-11-11

*通讯作者：魏晓星，副教授，研究生导师，Email： weixiaoxing@tsinghua.org.cn