活血化浊方对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤的干预作用

潘 霞，曹昌霞

(1.青海大学研究生院；2.青海大学附属医院)

活血化浊方对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤的干预作用

潘 霞1，曹昌霞2*

(1.青海大学研究生院；2.青海大学附属医院)

目的 探讨活血化浊方对缺血再灌注大鼠心肌损伤的干预作用及机理。方法 48只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、丹参组、活血化浊方高剂量组、活血化浊方中剂量组、活血化浊方低剂量组(各8只)。丹参组大鼠予丹参混悬液[1.5g(药物含量)/kg(大鼠体重)]，活血化浊方高、中、低剂量组大鼠分别予活血化浊方混悬液5.0、1.5、0.5 g/kg，均用生理盐水稀释至2 mL，假手术组及模型组予等量生理盐水。各组喂养4 W后，麻醉开胸，假手术组不做结扎，其余各组大鼠丝线结扎冠状动脉左前降支，30 min后，剪开丝线，再灌注60 min，建立实验性心肌损伤(I/R)模型。测定血清心肌酶谱五项(CK、CK-MB、AST、HBDH、LDH)水平；取大鼠心尖组织测定超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；观察各组大鼠心电图ST段变化情况。结果 造模后大鼠血清心肌酶谱五项，心肌组织SOD、MDA及ST段平均值均有不同程度变化；活血化浊方高、中、低组血清CK、CK-MB、LDH、AST、HBDH水平明显低于模型组，其高、中剂量组优于其他组；活血化浊高、中剂量组大鼠心肌组织SOD水平明显高于模型组及低剂量组和丹参组；MDA水平明显低于模型组及低剂量组和丹参组。各组大鼠冠状动脉结扎再灌注后ST段平均值：活血化浊方高、中剂量组低于模型组、低剂量组和丹参组，活血化浊低剂量组与丹参组比较无显著性。结论 活血化浊方对心肌缺血再灌注大鼠的心肌损伤有一定的干预作用，其机理可能与活血化浊方能够改善急性心肌缺血状态下的心肌酶谱，增加SOD的活性，减少MDA的产生，以及抑制心电图中ST段病理性抬高，保护心肌细胞免受损害相关。

缺血再灌注 心肌 损伤 活血化浊方

心肌梗死后的冠脉再通术、冠脉搭桥术及冠脉溶栓等技术可出现心肌缺血[1]，临床上通常会出现心律失常、血清心肌酶谱改变等。活血化浊方由黄芪、水蛭、红景天、红曲四味药组成，具有益气降浊，活血化瘀的功效。现代药理学研究表明，活血化浊方中的黄芪[2][3]、水蛭[4][5]、红景天[6][7]、红曲[8]通过多种途径对心肌缺血再灌注损伤(MI-R)发挥保护作用。本研究通过观察活血化浊方对心肌缺血再灌注大鼠血清心肌酶(CK、CK-MB、AST、HBDH、LDH)、心脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量及心电图ST段改变的影响，进一步探讨活血化浊方的应用对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤的干预作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠48只，雌雄各半，体重(180±10)g，甘肃省中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2013-0002，饲养于甘肃中医学院SPF级动物房。

1.2 药物、试剂与器材

1.2.1 药物和试剂

活血化浊方所用药物、丹参颗粒剂(广东一方制药有限公司)，生理盐水(青海大学附属医院药房)。MDA、SOD 及CK、CK-MB、LDH、AST、HBDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。将活血化浊方剂及丹参颗粒剂，用生理盐水配置成混悬液(0.5g/mL)。

1.2.2 实验器材

HX-300S动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，BL-420S生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)，DNM-9602酶标分析仪(北京朗新科技有限公司)。

1.3 造模方法

将48只大鼠适应性喂养3 d后，随机分为假手术组、模型组、丹参组、活血化浊方高、中、低剂量组。丹参组予丹参混悬液(1.5g/kg)，活血化浊方高、中、低剂量组分别按5.0、1.5、0.5 g/kg剂量进行灌胃，每日1次，每次2 mL，4 W后停止灌胃。参考王勇等[9]方法以30%乌拉坦腹腔注射麻醉动物(2ml/kg)，充分麻醉后将大鼠置于手术台上，固定大鼠的四肢及头部，在大鼠四肢皮下及心前区皮下插入针电极，备用(心电图机走纸速度为50mm/s，记录大鼠手术前5min，结扎后10、20、30min，再灌注60min后心电图)。在颈部和左前胸部备皮，于胸骨上窝上0.6 cm处，向上纵行切开皮肤1 cm，钝性分离深筋膜及颈阔肌，充分显露气管，充分止血后，于第3、4气管环间作倒T形切口，清理气管内分泌物，启动呼吸机(呼吸机的频率为70次/min，潮气量为8～12mL，呼吸比为2：1)，进行气管插管，顺利插管后，用丝线将气管插管的结合部环扎固定。左胸前备皮、铺巾，在胸骨左缘行纵行皮肤切口(长度约2cm)，钝性分离皮下及深浅筋膜，显露胸大肌，将胸大肌胸骨缘止点切断游离，靠近胸骨缘0.3 cm处钝性分离3、4肋间，用镊子提起第3、4肋软骨并剪断，并将胸膜钝性分离，撑开肋间露出心脏，拉钩拉开手术切口露出组织。用湿润的棉签小心推开心脏周围的肺组织，扩大手术的视野范围，镊子提起心包膜，用眼科剪剪开心包，棉签向上将胸腺推开，即可以看到明显的左心耳，以左心耳为标志(冠状动脉位于左心耳下方2～3mm，并有心大静脉与之伴行)，在其下方3 mm处，将穿好丝线的小圆针垂直进针(深度为0.5～1mm)，取开缝合针，在进针处以持针器放置约0.3 mm的硅胶小圆管，打结后将其固定，压迫左前降支造成血流阻断，以ECGⅡ导联ST段抬高0.5 mv或T波高耸、心肌颜色变为暗红色，作为冠脉结扎成功的标志。30 min后剪开结扎扣，再灌注60 min，即可形成大鼠缺血再灌注模型。迅速将大鼠腹腔打开，暴露腹主动脉并采血，取出心脏，用生理盐水清洗干净后，以眼科剪剪下适量心尖组织并称重，将0.2 g放入组织管中，置于-70 ℃冰箱保存。

1.4 指标测定方法

1.4.1 CK、CK-MB、LDH、HBDH、AST检测方法

将大鼠腹主动脉血静置2 h后放入离心机离心15 min(5000r/min)，取出上清液。离心后吸取血清，置-70 ℃冰箱保存。按试剂盒说明检测CK、CK-MB、LDH、HBDH、AST的含量。

1.4.2 SOD活性及MDA含量检测方法

从组织管中取出大鼠心尖组织0.2 g，用匀浆机将其研磨后装入离心管中，配制成浓度为0.2 g/mL的匀浆液备用。按试剂盒说明书测定SOD活性及MDA含量。

1.4.3 结扎后ST段抬高的平均数计算方法

分析所测不同时间点各组大鼠ST段变化值。将大鼠麻醉固定在手术台上时，测定大鼠正常的Ⅱ导联结扎前5 min及结扎后10、20、30 min的Ⅱ导联ST段的高度。计算结扎后ST段抬高的平均数。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血清心肌酶谱五项的比较结果(表1-2)

组别nAST(U/L)LDH(U/L)HBDH(U/L)假手术组8126.0±21.6500.3±39.9224.3±29.6模型组8422.6±43.0*2801.7±273.4*807.0±89.3*活血化浊高剂量组8251.9±25.6△*1367.5±133.5△*547.5±68.1△*活血化浊中剂量组8171.3±23.7△▽*830.7±75.6△▽*357.8±42.7△▽*活血化浊低剂量组8273.0±39.2△☆*1857.2±140.7△▽☆*596.1±51.5△☆*丹参组8266.9±26.3△☆*1066.1±97.6△▽☆□*469.5±48.6△▽☆□*F 86.91 254.1 95.83P <0.05 <0.05 <0.05

注： *与假手术组比较P<0.05；△与模型组比较P<0.05 ；▽与活血化浊高剂量组比较P<0.05 ；☆与活血化浊中剂量比较P<0.05；□与活血化浊低剂量比较P<0.05.

大鼠血清心肌酶谱中AST含量检测结果显示，假手术组均明显低于其余各组；模型组高于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组(P<0.05)；活血化浊方高剂量组高于中剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)，但与低剂量组和丹参组比较无显著性差异(P>0.05)；活血化浊方中剂量组低于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；低剂量组和丹参组无显著性差异(P>0.05)。

大鼠血清心肌酶谱中LDH含量检测结果显示，假手术组均明显低于其余各组；模型组高于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组(P<0.05)；活血化浊方高剂量组高于中剂量组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊方中剂量组低于低剂量组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊方低剂量组低于丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

大鼠血清心肌酶谱中HBDH含量检测结果显示，假手术组均明显低于其余各组；模型组高于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组(P<0.05)；活血化浊方高剂量组高于中剂量组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)，与低剂量组比较无显著性差异(P>0.05)；活血化浊方中剂量组低于低剂量组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊方低剂量组高于丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

组别nCK(U/L)CK-MB(U/L)假手术组81439.3±262.6403.3±52.1模型组86954.8±934.2*2350.3±303.2*活血化浊高剂量组84780.3±575.1△*1395.6±134.4△*活血化浊中剂量组82578.5±366.9△▽*784.5±63.6△▽*活血化浊低剂量组85587.5±571.6△▽☆*1624.1±69.8△▽☆*丹参组84259.5±440.3△☆□*1266.3±107.6△☆□*F 99.99 164.91P <0.05 <0.05

注：*与假手术组比较P<0.05；△与模型组比较P<0.05；▽与活血化浊高剂量组比较P<0.05；☆与活血化浊中剂量比较P<0.05；□与活血化浊低剂量比较P<0.05.

大鼠血清心肌酶谱中CK含量检测结果显示，假手术组均明显低于其余各组；模型组高于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组(P<0.05)；活血化浊方高剂量组高于中剂量组，低于低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)，与丹参组比较无显著性差异(P>0.05)；活血化浊中剂量组低于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊低剂量组高于丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

大鼠血清心肌酶谱中CK-MB含量检测结果显示，假手术组均明显低于其余各组；模型组高于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组(P<0.05)；活血化浊方高剂量组高于中剂量组，低于低剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)，与丹参量组比较无显著性差异(P>0.05)；活血化浊中剂量组低于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊低剂量组高于丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组大鼠心肌组织中MDA含量及SOD活性比较结果(表3)

组别nSOD(nu/mg)MDA(nmol/mg)假手术组87.44±0.411.24±0.54模型组85.06±0.20*2.41±0.27*活血化浊方高剂量组86.80±0.25△*1.75±0.53△活血化浊方中剂量组86.51±0.35△*1.58±0.79△▽

续表：

组别nSOD(nu/mg)MDA(nmol/mg)活血化浊方低剂量组85.82±0.30△▽☆*1.78±0.57△☆*丹参组85.91±0.23△▽☆*1.78±0.56△☆*F值 62.73 6.58P值 <0.05 <0.05

注： *与假手术组比较P<0.05；△与模型组比较P<0.05；▽与活血化浊高剂量组比较P<0.05；☆与活血化浊中剂量比较P<0.05.

各组大鼠心肌组织中MDA含量结果比较显示，假手术组低于模型组、活血化浊低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组高于其余各组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊高剂量组明显高于中剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)，与低剂量组、丹参组之间比较无明显差异(P>0.05)；活血化浊中剂量组低于低剂量组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；低剂量组及丹参组之间无明显差异(P>0.05)。

各组大鼠心肌组织中SOD含量结果比较显示，假手术组均明显高于其余各组，差异具有统计学意义(P<0.05)；模型组低于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊方高剂量组高于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)，与中剂量组比较无显著性差异(P>0.05)；活血化浊中剂量组高于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊低剂量组与丹参组无显著性(P>0.05)。

2.3 各组大鼠心电图ST段变化结果(表4)

Table 4 The rats ECG ST segment changes in different groups

注：*与假手术组比较P<0.05；△与模型组比较P<0.05；▽与活血化浊高剂量组比较P<0.05；☆与活血化浊中剂量比较P<0.05.

各组大鼠结扎前后及各组间结果比较显示，结扎前所有实验组之间ST段平均值差异无显著性(P>0.05)。结扎后：假手术组ST段平均值均明显低于其余各组；模型组高于活血化浊方(高、中、低)药物组及丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊方高剂量组低于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)，与中剂量组比较无显著性差异(P>0.05)；活血化浊中剂量组低于低剂量组和丹参组，差异具有统计学意义(P<0.05)；活血化浊低剂量组与丹参组无显著性(P>0.05)。

3 讨论

MI-R临床上表现为闭塞的冠状动脉再通、梗死区血液灌注重建一段时间内，发生血压骤降、心功能不全、心律失常甚至猝死的一系列病情反而恶化的现象。中医认为心肌缺血(冠心病、心绞痛、心梗等)证属“胸痹”范畴，胸痹主要病机为心脉痹阻，“活血化瘀，通脉止痛”是其中最重要的一个治疗原则。黄芪健脾益气，水蛭破血逐瘀，红景天益气活血、通脉平喘，红曲活血消食降脂，四药相合，共凑益气降浊，活血化瘀之功效。丹参自古是活血化瘀、通经止痛的佳品，临床上使用的复方丹参滴丸能有效及时缓解心绞痛。中医讲“气为血之母，血为气之帅”“气行则血行”，气血的运行相辅相成。本方中不仅有活血峻药，也配伍了益气药，现代病症中高脂血症亦是影响血流畅通一个重要因素，方中的红曲能够有效对抗高脂血症。所以探讨本方对心肌缺血再灌注后的干预作用及其机制有着重要意义。

MI-R发生后，心肌细胞会受损、坏死，心肌细胞膜通透性增加，由细胞内流向细胞外的心肌酶会增多，心肌酶中CK、CK-MB、LDH的升高被认为是心肌损伤时重要的标志酶，用以衡量心肌损伤程度[10]。实验中发现活血化浊方能减轻模型大鼠心肌损伤程度，降低血清CK、CK-MB、LDH水平，证实了该方具有抗心肌缺血及再灌注损伤的作用。

SOD是一种催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢酶，它可以保护机体细胞，免受氧化反应，保持正常的生理活性。心肌缺血再灌注时，会导致SOD病理性的降低，从而加剧心肌细胞氧化反应，使细胞受到破坏。MDA是膜脂质过氧化的产物之一，它的产生能加剧细胞膜的损伤，MDA的含量可以推定细胞膜的受损程度[11]。本实验中，模型组大鼠心肌组织SOD活性水平降低、MDA含量升高，提示存在明显心肌组织脂质过氧化，活血化浊方高、中剂量组显著降低了模型大鼠的MDA水平，提高了SOD活性水平，这可能是该方防治心肌缺血再灌注损伤的重要机理。

本实验显示，结扎后各组大鼠ST段均有不同程度的抬高，尤其以模型组的抬高最为明显，活血化浊方药物组及丹参组均能有效降低ST段抬高水平，但活血化浊高、中剂量组优于丹参组。

综上所述，活血化浊方能够改善急性心肌缺血状态下的心肌酶谱，增加SOD的活性，减少MDA的产生，以及抑制心电图中ST段病理性抬高，保护心肌细胞免受损害。然而心肌缺血缺氧损害的机制是多方面的，本实验肯定了活血化浊方对于心肌缺血再灌注时对心肌的保护作用，但具体机制还不够明确，有待进一步研究。

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Intervention effect of huo xue hua zhuo prescription on myocardial ischemia reperfusion injury in rats

Pan Xia1，Cao Changxia2*

(1.Medical College of Qinghai University；2.Affiliated Hospital of Qinghai University)

Objective To discuss the intervention effect and mechanism of Huo xue hua zhuo prescription on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.Method 48 Wistar rats were randomly divided into sham-operated group，model control group，Salviae miltiorrhizaegroup and Huo xue hua zhuo prescription high，medium，low dose groups(8 rats in each group).Rats in Salvia miltiorrhiza group were given salviae miltiorrhizae mixed suspension with dose of 1.5 g/kg；rats in Huoxue hua zhuo prescription high，medium and low dose groups were given Huo xue hua zhuo prescription mixed suspension 5.0，1.5，0.5 g/kg，all medicinal herbs were diluted with saline water to 2 ml；rats in sham-operated group and model group were given equal dose of normal saline.4 weeks after feeding all groups were performed anesthesia and thoracotomy：the sham-operated group without ligation，the rest of the groups were ligatured the left anterior descending coronary arteries by silk suture for 30 minutes，then cut the silk suture，reperfusion For 60 minutes，experimental myocardial injury(I/R)model was established.The levels of serum myocardial enzyme spectrum(CK，CK-MB，AST，HBDH，LDH)were detected.After taking some apex tissue in rats，the levels of Superoxide Dismutase(SOD)and Malondialdehyde(MDA)Were also detected.Meanwhile，the ST segment changes in electrocardiogram in each group were observed as well.Result After successfully modeling，the serum myocardial enzymes，SOD and MDA of myocardial tissue and ST segment average were changed in different degree.The CK，CK-MB，AST，HBDH，LDH levels of Huo xue hua zhuo prescription high，medium，low dose groups were significantly lower than those in the model control group.The indexes mentioned above in High，medium dose group were superior to other groups.The myocardialtissue SOD level in high，medium dose group was obviously higher thanthat of model control group and low dose group.The MDA level in salvia miltiorrhiza group was significantly lower than that of the model control group，low dose group and salvia miltiorrhiza group.The ST segment average in each group with coronary artery ligation after reperfusion showed that：Huo xue hua zhuo prescription high and medium dose group were lower than that of the model control group.But there was no significant differences in low dose group and salvia miltiorrhiza group.Conclusion Huo xue hua zhuo prescription against myocardial ischemia reperfusion rat myocardial injury has certain intervention effect.It may be related to Huo xue hua zhuo prescription can improve the myocardial enzyme spectrum of acute myocardial ischemia condition，increase the activity of SOD，to reduce the production of MDA，inhibiting the ST segment pathologically elevated and protecting the myocardial cells from injury.

ischemia reperfusion myocardium injury Huo xue hua zhuo prescription

R242

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.009

2015-10-10

潘 霞(1989～)，女，汉族，重庆籍，青海大学研究生院中西医结合研究生 *：通信作者，教授，主任医师，硕士研究生导师，824443911@qq.com