青海地区回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多态性研究*

沈国双，郑方超，赵久达

(青海大学附属医院，西宁 810001)

青海地区回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多态性研究*

沈国双，郑方超，赵久达※

(青海大学附属医院，西宁 810001)

目的 探讨青海地区回族胃癌患者PLCE1 rs3765524基因多态性。方法 采用1：1匹配病例对照研究。选取78例青海大学附属医院胃癌住院病例为病例组，按年龄、性别、民族匹配正常对照组。利用TanMan_MGB探针法对78例病例和78例对照进行PLCE1基因 rs3765524位点基因型检测，比较、分析病例组和正常对照组间的该位点基因型频率的分布差异。结果 PLCE1基因rs3765524位点基因型的分布频率在病例组和正常对照组之间的差异无统计学意义(P=0.207，P=0.075)。结论 PLCE1基因rs3765524位点C>T的多态性改变与青海地区回族人群胃癌患病易感性之间无关联。

胃癌 回族 PLCE1 基因单核苷酸多态性

第三次全国全死因调查结果显示，青海省胃癌发病率高居全国第二位，尤其是藏族和回族人群胃癌发病率较高[1-2]。本研究拟对该地区特定民族胃癌高发的原因及发病机制进行相关研究。磷脂酶Cε1 (Phospholipase C epsilon-1， PLCE1)是近年来发现的磷酸酶C家族的一种同工酶、癌基因，位于人第10号染色体长臂2区3带(10q23)，其能够激活IP3/Ca2+、DG/PKC、EPK和MAPK等信号通路介导细胞信号传导，参与细胞生长、分化、凋亡和血管生成等过程[3-4]。rs3765524定位于PLCE1基因第24个外显子，其突变可导致第1 777位氨基酸编码由苏氨酸变为异亮氨酸(ACC1777ATC)[5]。近年来的研究发现，PLCE1基因rs3765524位点C>T的多态性改变与人群胃癌和食管癌的发病易感性显著相关[6-9]。此外，本研究团队早期发现青海地区汉、藏族人群胃癌患病易感性可能与PLCE1基因多态性有关[10]。考虑到种族及区域因素对遗传背景的影响，本研究利用1：1匹配病例对照研究，探索PLCE1基因rs3765524位点C>T的多态性改变是否可以增加青海地区回族人群胃癌的患病风险，以期为该地区回族人群胃癌早期诊断和靶向治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择

从青海大学附属医院2010年10月至2011年10月间住院的胃癌患者中选取无血缘关系患者78例，年龄54.07±10.30岁，男性45(57.69%)例。所有胃癌患者要求世居青海，无与其他民族通婚情况，进行R0切除术后经组织病理学证实，且未进行新辅助放射治疗和抗肿瘤药物治疗。78例正常对照者，为同时期世居青海、无与其他民族通婚史、无肿瘤病史，且其他条件匹配的病例组1：1匹配。

研究方案经青海大学附属医院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。由经过统一培训的调查员，使用统一调查表对每个研究对象进行面访，调查内容包括基本人口学资料及环境暴露史、H.pylori感染史及恶性肿瘤家族史等资料，并采集外周血5 mL。

1.2 PLCE1基因rs3765524位点基因分型

所有血样标本添加EDTA-K2抗凝，分装后行程序降温，最终置-80 ℃冰箱内保存。采用全血DNA提取试剂盒(TianGen)按步骤提取，并纯化全血基因组DNA。

根据NCBI数据库报道人类PLCE基因DNA序列，利用Primer Premier 5软件设计rs3765524位点PCR引物序列为：

上游5′CGTCTGTGTCGCAGGTATTCTC 3′，

下游5′GGGTTCGGGTTGGAAGAGTC 3′。

随后在上海基康生物技术有限公司订购Taqman-MGB探针，Probe1：FAM-AAACTGACCCAGCACA-MGB，Probe2：HEX-AAACTGATCCAGCACAC-MGB。PCR反应体系及扩增条件：PCR反应总体系为25 μL，含100 ng/mL DNA模板2 μL，10×缓冲液215 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L引物1 μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL。反应在温度梯度PCR仪 (美国ABI公司)进行，条件为：95 ℃变性 30 s，61 ℃退火40 s，72 ℃后延伸1 min，进行36个循环。最后，取PCR产物2 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定扩增产物。

根据7900HT定量PCR仪(美国ABI公司)终点读板法基因分型操作流程，利用定制的TaqMan-MGB探针对PLCE1基因rs3765524位点进行基因分型。此外，由于DNA数量和质量等原因，导致未能成功进行分型的标本则需重新进行分型。所有标本分型完成后，随机抽取5%标本进行DNA测序验证。

1.3H.pylori感染状况检查

采用14C-尿素呼气试验(14C-UBT)对上述研究样本进行幽门螺杆菌(Hp)感染检查。14C-UBT使用无效放射性的稳定同位素进行检测，具有较高的敏感度(>95%)和特异度(>95%)，适用于各个年龄段人群H.pylori感染的诊断和治疗后的复查。

1.4 统计学处理

应用SAS 9.1.3软件，采用χ2检验方法或Fisher确切概率法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料信息的比较分析

78例胃癌患者和78例正常对照按照年龄、性别和民族相同的条件进行1：1匹配。与正常对照人群相比，青海地区回族胃癌患者的吸烟史阳性(15.38%vs.34.62% )、肿瘤家族史阳性( 24.36%vs.61.54%)和H.pylori感染史阳性(33.33%vs.55.13%)人群的比例均显著性升高，提示家族遗传因素和H.pylori感染因素可能是胃癌发病的危险因子，详见表1。

表1 病例组和正常对照组患者的一般信息(%)

Table 1 Comparison of general characteristics between cases and controls

2.2 PLCE1基因rs3765524位点基因型多态性分析

在78例正常对照人群中，PLCE1基因rs3765524位点CC、CT、和TT基因型分别占64.10%、34.61%和1.28%，T等位基因的频率为0.19，且该位点T等位基因在正常对照中的分布符合Handy-Weinberg平衡(χ2=1.61，P=0.447)，提示对照组人群具有良好的代表性，详见表2。此外，78例胃癌患者中CC、CT和TT的基因型频率分别为50.00%、46.15%和3.85%，T等位基因的频率为0.27，详见表2。

表2 病例组和对照组中PLCE1基因rs3765524(C>T)位点基因频率

Table 2 Distribution of genotypes of PLCE1 rs3765524(C>T)in cases and controls

2.3 PLCE1基因rs3765524位点基因型多态性与青海地区回族人群胃癌患病易感性的关系

PLCE1基因rs3765224位点基因型分布及其与青海地区回族人群胃癌患病易感性之间的关系详见表2。如表所示，该位点基因型频率在病例组和对照组之间的分布差异无统计学意义(P=0.207，P=0.075)。

3 讨论

遗传变异可通过影响基因的表达，导致蛋白质结构和功能发生改变，进而影响细胞信号传导，改变细胞生命活动，引起细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等行为，最终引发肿瘤或其他疾病的发生[5]。许多报道结果表明[6，7，10]，PLCE1基因突变与胃癌患病易感性密切相关，然而PLCE1基因rs3765524位点单核苷酸多态性与胃癌之间关系的报道则相对较少。

本研究在前期研究的基础上，利用匹配病例对照设计，在青海省回族人群中探讨PLCE1基因rs3765524位点单核苷酸多态性与胃癌患病易感性之间的关系。结果证实，PLCE1基因rs3765524位点C>T的多态性改变并未显著增加青海地区回族人群胃癌的患病风险。

PLCE1基因rs3765524位点单核苷酸多态性与胃癌患病风险之间的关联，最早由Abnet等[6]人在中国太行山脉地区上消化道肿瘤高发区开展的全基因关联研究中发现，其对2 240名胃腺癌患者和3 302名共同正常对照者进行分析，发现rs3765524位点C>T的多态性突变可以使该地区人群胃癌发病风险增加31%。随后，Mou等[11]人在中国汉族人群中对200例胃癌患者和134名正常对照者的研究中进一步证实了rs3765524位点C>T的多态性改变与胃癌患病易感性之间的关联。此外，梁平等[5]通过对西北地区476例胃癌患者和481例健康人群的研究，再一次证实PLCE1基因rs3765524位点C>T的多态性改变与我国西北汉族人群胃癌易感性显著相关。

但是，本研究的结果与上述者的研究结果不同，究其原因可能如下：(1)所有纳入分析的78例胃癌患者均未进行Lauren分型，继而未进行深入分析，研究显示[12]Lauren分型可以反映肿瘤的生物学行为，特别是在弥漫性胃癌患者中，其一般不伴萎缩性胃炎和胃黏膜上皮化生，且与个体的遗传易感性密切相关。(2)本研究未考虑胃癌发生的部位，一般认为贲门癌和非贲门癌由于解剖位置的差异，导致其分子生物学特性也不同，提示胃癌的发生部位在胃癌的发生过程中起到重要作用。(3)本研究纳入分析的样本量较小，导致多因素分析时无法达到较高的检验功效进而掩盖其真实的效应。因此，扩大样本量，纳入Lauren分型和胃癌发生部位信息，将有助于全面研究PLCE1基因rs3765524位点单核苷酸多态性与胃癌患病易感性之间的关联。

此外，需要注意的是，胃癌是一种与H.pylori感染史密切相关的肿瘤，且这种关联在大量研究已经得到确认[13-14]。然而本研究中，纳入研究的人群中H.pylori感染的检出率为44.23%，远低于全国56.22%的平均检出水平[15]，尤其是正常对照人群中，分析其原因可能与青海地区回族人群生活习惯以及纳入研究病例数较少有关[16]。

综上所述，本研究认为，在青海地区回族人群中PLCE1基因rs3765524位点C>T的多态性改变与该地区回族人群胃癌患病易感性之间无显著性关联，提示该位点基因型的多态性可能不是改变该地区回族人群胃癌患病易感性的遗传因子。

此外，由于不同地域人群生活环境和遗传背景存在差异，且本研究存在样本量小、未进行Lauren分型和未考虑肿瘤发生部位等不足，因此本研究结论尚需大样本研究确认。

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Polymorphisms of PLCE1 rs3765524 among Hui patients with gastric cancer in Qinghai area

Shen Guoshuang，Zheng Fangchao，Zhao jiuda

(Department of Breast and Thyroid Surgery，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining，Qinghai 810001)

Objective To explore the polymorphisms of PLCE1 rs3765524 among Hui patients with gastric cancer in Qinghai area.Methods 1：1 matched case-control study was conducted.78 patients with gastric cancer in Qinghai University Affiliated Hospital were recruited as case group，healthy controls were matched according to the same age，sex，and nationality.Genotypes of PLCE1 rs3765524 were detected using TapMan-MGB method among 78 gastric cancer cases and 78 matched healthy controls，then the difference in genotype frequencies of PLCE1 rs3765524 was analyzed between cases and controls.Results No significant difference in genotype frequencies of PLCE1 rs3765524 was observed between cases and controls，with P value being 0.207 or 0.075.Conclusions These findings suggest that the mutation from C to G of PLCE1 rs3765524 is not associated with Hui patients with gastric cancer in Qinghai area.

Gastric cancer Hui population PLCE1 Gene Polymorphism

*：青海省科技厅应用基础研究计划项目(2012-Z-739) 沈国双(1976～)，男，土族，青海籍，硕士，副主任医师

R394.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.01.006

2015-03-04

※：通讯作者，博士，Email_jiudazhao@126.com