老年性聋耳蜗带状突触数量在时空上的改变

王驰柳柯赵立东候琨施磊杨仕明宁博江苏省徐州市中心医院耳鼻咽喉科(江苏009）解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所（北京0085）中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科（沈阳000）



老年性聋耳蜗带状突触数量在时空上的改变

王驰1柳柯2赵立东2候琨2施磊3杨仕明2宁博1
1江苏省徐州市中心医院耳鼻咽喉科(江苏221009）
2解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科，解放军耳鼻咽喉研究所（北京100853）
3中国医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科（沈阳110001）

【摘要】目的研究年龄相关性听力损失过程中听力阈值变化与耳蜗内毛细胞带状突触标记物数量之间的关系。方法应用C57BL/6J小鼠进行本研究。在本研究中，对鼠龄为1、2、4、6和12个月的C57BL/6J小鼠分别进行ABR阈值检测分析(Click & Tone burst)。对被检测小鼠的耳蜗基底膜标本进行突触前特异蛋白RIBEYE/CtBP2进行免疫荧光标记，采用激光共聚焦观察结合三维重建的方法来计数突触标记物(RIBEYE/CtBP2)的数量并进行统计学分析。结果小鼠的ABR阈值从鼠龄4个月时开始出现显著抬高(P<0.05)，以后在鼠龄为6和12个月时抬高更加明显。在频率分布上，这种阈值的抬高在高频区域(8KHz & 16KHz)表现的最为明显。同时，本研究发现标记物的数量和ABR阈值的变化呈现一致性的改变：突触标记物数量也在4个月时开始出现减少(P<0.05)，且随着鼠龄的增加数量减少更加明显。这种数量减少的表现在高频区域(8KHz & 16KHz)表现得尤为显著(P<0.01)。在听力减退的早期阶段(鼠龄4-6个月)，小鼠毛细胞，尤其是内毛细胞数量并未现明显的减少。结论老年性听力损失和耳蜗带状突触的数量改变密切相关，突触数量的减少可能是导致年龄相关性听力损失的一个重要因素。

【关键词】老年性聋；C57小鼠；耳蜗带状突触；RIBEYE/CtBP2；内毛细胞；

对于这个突触结构在老年性聋发生、发展过程中是否发挥作用以及发挥何种作用的问题，长期以来一直鲜有报道。Stamatak等发现衰老过程中突触后神经末梢存在折叠结构，这种结构似乎影响了动物的听力水平[1]。在前期的研究中发现小鼠的带状突触数量在衰老过程中也发生了显著变化，这种变化和听力的变化之间存在一定的相关性。下面就将这方面的研究结果作系统性的报告。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

本实验采用SPF级C57BL/6J (由中国军事医学科学院动物中心提供)进行，共选取50只小鼠（100个耳蜗），入组要求ABR听阈正常，排除中耳及内耳疾病。动物随机分为5组，每组10只。分别在鼠龄为1个月、2个月、4个月、6个月和12个月时对其听力水平进行听性脑干反应（ABR）检测。本研究所有实验操作均得到中国人民解放军总医院动物伦理委员会的批准。

1.2听功能测试

动物分别于鼠龄1M,2M,4M,6M和12M时行双耳ABR阈值测试，采用美国TDT测听设备，Biosig测听软件对小鼠进行ABR阈值检测。实验在隔声屏蔽室内进行，测听前使用10%水合氯醛（4.5ml~5ml/Kg，腹腔注射）对小鼠进行麻醉。麻醉满意后，将记录电极置于小鼠两侧耳廓前缘连线中点皮下，参考电极置于测试耳耳垂，接地电极置于对侧耳耳垂，测试耳机距外耳道口约0.5cm，检测小鼠双耳的ABR阈值。实验采用短声（Click）和短纯音（Toneburst，Rise/Fall time:1 msec；Duration:4 msec）作为刺激声，带通滤波为300～3000 Hz，叠加次数为1024次，扫描时间10ms。刺激强度自90dBL SPL开始，以10dBL逐渐递减，直至检测不出重复的ABR波形，再向上增强5dBL，直至能检测出重复的ABR波形，此刺激声强度即为小鼠的听阈。

1.3耳蜗Corti器标本制备

颈椎脱臼法处死小鼠，迅速将其断头，快速取出耳蜗，将小鼠耳蜗放人盛有4%多聚甲醛溶液的培养皿中。在解剖显微镜下，用细针在蜗顶钻孔，并开放圆窗和卵圆窗。用4%多聚甲醛溶液自蜗顶进行灌流，冲出淋巴液。将已灌流的耳蜗标本置于4%多聚甲醛溶液中继续固定，4℃冰箱过夜。取出标本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA，北京化工厂）溶液中脱钙

在车间排放方面，目前的管理过于严格，相关部门要求，在汽车启动状态下，需要对汽车尾气进行处理，但其实即使汽车不在修理厂内，在路上行驶，尾气排放也随时都在发生。

1.4免疫荧光染色

将分离好的基底膜置于0.5%Triton X-100中30 min，PBS冲洗3次，含5%山羊血清、2% BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白)的PBS封闭液阻断非特异性位点2 h，羊抗鼠Ctbp2 (E-16)抗体(1 :200,SANTA CRUZ) 4℃过夜，PBS冲洗3次；牛抗羊IgG FITC(1:100,SANTA CRUZ)，37℃避光染色40min，PBS冲洗3次，蒸馏水冲洗1次。最后用Dapi染色液(SANTA CRUZ)避光染色15min，再用PBS溶液漂洗2遍，5min/遍。解剖显微镜下将基底膜标本平铺于载玻片上，甘油封片。

1.5激光共聚焦显微镜成像及突触标记物数量计数

激光共聚焦显微镜型号为：Leica TCS SP2 AOBS,激发光波长为488 nm和543 nm，100×油浸物镜下观察，并局部数字放大2倍。对所观察区域的内毛细胞进行序列扫描，扫描层距设定为0.2µm。本实验中，被标记的突触前特异蛋白RIBEYE/CtBP2因使用FITC而显示绿色荧光.序列扫描始于荧光色对出现,止于荧光色对消失。采集二维图像,每一组序列图像文件置于一个文件夹内,并按序号排列。对10条耳蜗基底膜的顶回进行序列扫描,每个基底膜扫描3个视野(顶、中、底各1个视野)，共生成10个序列文件。

1.6应用3DS MAX进行三维建模

在3DS MAX 8中的顶视窗口中按序列扫描时由上至下的顺序调入采集的二维图像做为视口背景.先调入第一幅二维图像,在出现绿色荧光的位置画球体作为标记.再调入下一幅,如果出现绿色荧光的位置与上一幅相同,不做标记,认为是同一个突触部位;如果在其他位置上出现绿色荧光,则表示在这一层面上有新的突触出现,再用球体做出标记.以此类推,最后得出这种突触标记物数量。依次对各个序列文件中的每幅二维图象中的荧光位置进行标记，最后完成对10个序列文件内全部二维图片的扫描和标记，剔除其中重复标记的荧光部位，之后对于所有被标记的绿色荧光球体进行数量计数，得出总计突触标记物数量。突触标记物总数除以绿色标记物所在区域中的全部内毛细胞数量，即得到每个内毛细胞上突触标记物的数量(以均数±标准差显示)。

1.7统计学处理

本实验中，听性脑干反应(ABR)阈值和突触标记物数量以均值±标准差(x±SD)表示，并采用one way ANOVA检验比较组间差异，两两比较等用SNK法。所有数据均输入SPSS18．0软件统计，P < 0.05表明组间差异具有统计学意义。

2　结果

2.1衰老过程中的听力损失

本研究中，首先检测了C 57小鼠在衰老过程中听力损失的情况。在本研究的Click检测中，1月组小鼠为9.58±2.85，2月组小鼠为10.34±3.05，4月组小鼠为24.12±4.14，6个月组小鼠为37.65± 5.51，12个月小鼠组为72.18±6.80。组间差异分析显示，1，2个月鼠龄组间无显著性差异（图1，P > 0.05）。然而对鼠龄为4，6，和12个月的阈值检测却显示出了明显不同的结果。阈值在4个月小鼠中出现显著升高，在6个月和12个月小鼠中阈值继续抬升，统计显示，以上三组均与4月鼠龄之前各组存在显著性差异(P < 0.05)。而且6，9和12月三组之间也存在显著性差异(P < 0.05)。说明在衰老过程中，C57小鼠的ABR(Click)阈值是处于不断升高的状态下的。

图1　鼠龄分别为1,2,4,6,和12个月C57小鼠的Click阈值Fig.1 ABR threshold (Click) at the age of 1,2,4,6,and12 months in C57BL/6J mice (Mean±SD)

同样地，还比较了各频率上不同鼠龄小鼠的听力水平。发现C57BL/6J小鼠在鼠龄分别为1个月和2个月时，即使在不同频率上也没有表现出具有统计学意义的阈值变化（见表1）。而对于鼠龄分别为4个月、6个月和12个月的小鼠来说，tone brust的检测结果则显示出了明显的变化：即越是处在高频区域中（底回区域），小鼠听力阈值抬升的幅度越大。比如在本研究中，6个月鼠龄的小鼠听阈值分别为56.53±7.11 (8KHz)和66.34±8.36 ( 16KHz)。而12个月鼠龄小鼠分别为77.26±8.16 (8KHz)和81.44±9.22 (16KHz)，与2个月鼠龄组比具有统计学差异（P < 0.001）。

表1　C57小鼠在衰老过程中听力-频率变化(均值±标准差)Tab.1 The alterations of hearing threshold across frequency in the duration of aging (Mean±SD)

More significant elevations of hearing threshold have been found at the region of high-frequency.The initial elevation has been identified at the mice of 4 months old.

2.2衰老过程中带状突触数量的变化

为了探讨听力、频率和带状突触的突触前标记物数量之间的变化关系，利用3D max软件结合免疫荧光标记方法计数不同鼠龄C57小鼠耳蜗不同回段上的突触前标记物数量（图2，RYBEYE/CtBP2）。发现这个突触前标记物的数量变化和小鼠ABR (tone brust)阈值的变化基本遵循一致的规律：即在大鼠龄小鼠耳蜗的高频区域出现了标记物数量上的最显著下降，而在低频部位数量变化的幅度则要明显平缓（图2）。相比较而言，即使是较高鼠龄的小鼠，其低频区域的突触标记物数量变化也要相对和缓（图2）。

图2　C57小鼠耳蜗内毛细胞突触前特异蛋白RIBEYE的免疫荧光标记.Fig.2 Immunostaining labeling for specific pre-synapse protein (RIBEYE) in the cochlear IHC ribbon synapses in C57BL/6J mice.

Upper panel shows immunostaining evidence for specific pre-synaptic protein (RIBEYE/CtBP2) in cochlear ribbon synapses below inner hair cells in the mice (2 months old),from left to right is apex,middle,and basal turn,no significant reduction of synaptic labeling has been found at this panel.Lower panel reveals immunostaining results in the older mice (6 months old),a significant loss of synaptic ribbons is identified at the basal turn.Blue indicates DAPI staining identifying neclui; Green spot indicates specific pre-synapse protein (RIBEYE),white arrow indicated.Scale bar=5um.

本研究中计数了鼠龄1个月到12个月各回段的突触标记物数量，结果显示在幼-青年小鼠中，其耳蜗内毛细胞下的突触标记物数量比较多，但是在鼠龄小于6个月时，各组小鼠的突触标记物数量变化不明显(P>0.05，表3)。随着C57小鼠的鼠龄增大（> 6个月），突触标记物数量出现了下降(P<0.05，表3)，到鼠龄为12个月大小时，突触标记物数量的减少变得明显(P<0.05，表3)，而且这种数量上的减少在底回（高频区域）表现的更加显著(P < 0.01，表3)。

表2　衰老过程中C57小鼠内毛细胞带状突触前标记物在各频率上的数量分布(单位:每个内毛细胞)Tab.2 The distributions of cochlear ribbon synapse across frequency in C57BL/6J mice during aging (per IHC).

There are no significant differences among the mice of 1,2,and 4 months age.The reduction of cochlear ribbon synapse has been firstly identified at the mice of 6 months age.Significant loss of ribbon synapses is found at the mice of 12 months age,P<0.05.The maximal reduction of cochlear ribbon synapses is identified at the region of basal turn compared with apex and middle turns,P<0.01.

3　讨论

本研究结果表明，伴随着小鼠的衰老过程，其ABR听阈值也相应地升高。而且，在耳蜗的高频区域（8-16kHz），小鼠的听阈值更是呈现出了快速抬升的趋势。同样，计数同一过程中的突触前标记物数量(RIBEYE/CtBP2)，发现了和听力变化呼应的变化趋势：即6个月之后的小鼠各个频段上的标记物数量均出现了下降，在高频区（8-16kHz）标记物数量下降得更加明显。而且这种趋势随着鼠龄的增长变得越发明显。

先前的研究都证实了随着年龄的增长，小鼠内外毛细胞都会出现缺失的情况，这种毛细胞数量上的缺失在外毛细胞上表现得更加明显，相比较而言，内毛细胞的缺失在高龄小鼠身上才会有明显的表现[2,3,13]。但是事实上内毛细胞下传入神经突触的减少在小鼠相对比较年轻时就发生了，试验的结果给这个结论提供了证据。之前的研究发现，内毛细胞传入神经突触对于耳毒性刺激十分敏感，这种敏感性显著高于耳蜗其它部件，比如外毛细胞、内毛细胞、螺旋神经等结构[9]。其他学者在噪声环境下研究这个突触结构，发现中等强度的噪声可以引起暂时性听阈变化，但是突触的数量却不能完全恢复[12,14]。也有研究发现，不仅听力的损害是可以恢复的，突触标记物数量似乎也有完全的恢复[8]。两种条件类似的实验结果并不完全一致，可能的解释目前主要来自于动物的区别，前者的实验所应有的动物为小鼠[12]，后者的动物为豚鼠[8]，同样的声音刺激在不同动物耳蜗当中所产生的影响可能存在差别。所使用的动物是具有年龄相关性特点的C57小鼠，突触数量和空间分布上的变化主要反应老年性听力损害的一些特点。但是上述这些实验结果至少有一个特点是共同的，即听力损害性因素，不论是耳毒性暴露、噪声性暴露、或者是衰老性因素，耳蜗内毛细胞传入神经突触都会首先感知上述因素的影响并最早做出适应性改变。

目前同类研究中一个比较棘手的问题是还没有一种有效的检测方法，来评估各种状态下耳蜗内毛细胞传入神经突触的功能。ABR检测无疑不能准确反映这个突触功能的情况，目前有些研究通过检测CAP的方法来估计这个突触的功能状况[14,15,16]，但是这个电位实际上是听神经末梢和毛细胞之间的总和电位，这个电位并不能准确代表耳蜗内毛细胞传入神经突触的电位值。有学者通过检测听神经束自发放电频率来估计突触的功能，具有一定的可操作性和合理性，但是仍然不是一种理想的检测手段。未来的解决方法之一是对新生动物的基底膜标本进行培养[17]，待培养的标本状态稳定后检测突触后兴奋电位或电流(EPSP&EPSC)，尽管有研究报道可以检测到单个带状突触的兴奋性电位或电流[18,19,20]，然而我们在实际检测中发现单个或少数突触的电位值很小难以检测。比较可行的方法是对多个内毛细胞区域的突触后兴奋性后电位或电流值进行检测，以得到这个区域的突触后总和电位或电流值。通过设置相同数量内毛细胞的对照区域，人为破坏内毛细胞及突触的方法来消除其它干扰因素，两者相减得到比较准确的突触后电位或电流数值。然而检测活体动物的带状突触功能目前看来依然是一个难以完成的任务，可能还需要进行长时间的探索或依赖于大的技术突破，就当前情况而言，通过分析ABR I波的潜伏期或幅值，或者通过分析CAP幅值依然是一个既可行又有效的功能性评估手段。

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·听觉研究新模型专辑·

Time and frequency dependent changes of cochlear ribbon synapses in age-related hearing loss

WANG Chi1,LIU Ke2,HOU Kun2,SHI Lei3,YANG Shiming2,NIN Bo1
1Department of Otolaryngology Head and Neck surgery,Central Hospital of Xuzhou,Jiangsu Province,221009 2Department of Otolaryngology Head and Neck surgery,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853 3Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang,110001
Corresponding author:NING BoEmail:boxuzhou@126.com

【Abstract】Objective To study possible correlations between the number of cochlear ribbon synapses and elevation of ABR thresholds related to aging.Methods C57BL/6J mice were utilized to mimic age related hearing loss in this study.ABR threshold was examined at 1M,2M,4M,6M,and 12M respectively.Immunostaining combined with laser confocal microscopy was used to identify RIBEYE/CtBP2,a specific pre-synaptic component of cochlear ribbon synapses,and the number of labeling synaptic ribbons was calculated using the 3D max 8.0 software.Results ABR threshold elevation was first found after 4M (P<0.05),and continued to increase at 6M and 12M (P<0.05).Further,the most significant ABR threshold elevation at a given age was identified at high frequencies (P<0.01,8 and 16 kHz).Correspondingly,the reduction of labeling ribbon synapses was noticed along with ABR threshold shifts as the mice aged,also with more labeling synapses reduction in the high frequency regions (P<0.01,8 and 16 kHz).However,we did not find significant loss of inner hair cells in during the same aging period.Conclusion There is faithful correlation between hearing threshold shifts and reduction of labeling synaptic ribbons,with most reduction occurring in high frequency regions.This study shows that the loss of ribbon synapses may contribute to age-related hearing loss.

【Key words】Age-related hearing loss ; C57 mice; Cochlear ribbon synapse ; RIBEYE/CtBP2; Inner hair cell;

收稿日期：（2016-01-06）

通讯作者：宁博，Email :boxuzhou@126.com

作者简介：王驰，研究生，主治医师，研究方向：耳鼻咽喉基础与临床

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.007

【中图分类号】R764.436

【文献标识码】A

【文章编号】1672-2922（2016）01-32-5