李亚张悦赵立东郭维维潘红梅张亮袁硕龙任丽丽时晰1,杨仕明乔月华1徐州医学院听力中心,徐州1006中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科北京1008533徐州医学院附属医院临床听力中心,徐州1006重庆市畜牧科学院重庆060
小型猪肌源性诱发前庭电位的检测
李亚1,2*张悦2*赵立东2郭维维2潘红梅4张亮4袁硕龙2任丽丽2时晰1,2杨仕明2乔月华1,3
1徐州医学院听力中心,徐州221006
2中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科北京100853
3徐州医学院附属医院临床听力中心,徐州221006
4重庆市畜牧科学院重庆402460
【摘要】目的探索小型猪肌源性诱发前庭电位(Vestibular-evoked myogenic potential,VEMP)的最佳检测方法。方法选取正常成年的雌性小型巴马香猪,以3%戊巴比妥钠+速眠新Ⅱ进行麻醉之后,用自制装置进行固定,1000Hz强短声诱发颈部伸肌肌源性电位和咬肌肌源性电位,并记录其波形;结果颈部伸肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期7.65±0.64ms,振幅1.66±0.34uv,80dBSPL的引出率为75%;咬肌诱发肌源性电位,第一个正向波P的潜伏期7.60±0.78ms,振幅1.31±0.28uv,80dBSPL的引出率为66%。结论小型猪颈部伸肌和咬肌在强声下诱发的肌源性电位潜伏期和阈值均一致;颈部伸肌部位所记录到的VEMP波幅稍高于咬肌部位记录到波幅;但相比之下,咬肌位置表浅,便于定位,肌肉组织发达,肌紧张性强,更易于肌源性诱发电位的记录。
【关键词】肌源性诱发前庭电位;小型猪;咬肌肌源性诱发前庭电位
李亚和张悦并列第一作者
National Natural Science foundation of china general project(81271082); The national 973 program of major scientific research program stem cell project(2012CB967900); The national 973 plan major scientific problem oriented project(2011CBA01000); Cultivation and development of Beijing science and technology innovation base(z151100001615050).Jiangsu province clinical medical science and technology specialb(12014032),The peak of six talents in Jiangsu Province2014-WSN-043,China Postdoctoral fund(2015M5718180,Innovation and entrepreneurship training program for college students in Jiangsu Province(201510313003Z),The fundamental research funds for the project of Chongqing City(11611、14440).Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.
肌源性诱发前庭电位(Vestibular-evoked myo⁃genic potential,VEMP)指利用高强度声刺激一侧球囊并在同侧紧张的胸锁乳突肌上记录到的肌源性诱发前庭电位,来评价前庭功能的一种客观、准确的电生理测试技术[1],操作方便、结果可靠、具有较高的特异性,对突发性耳聋,梅尼埃病、前庭神经炎等疾病的诊断和判断病情的预后有较高价值;由于神经传输通路的不同,VEMP可分在眼外肌前庭诱发肌源性电位(ocular vestibular-evoked myogenic potential,oVEMP)和颈部肌前庭诱发肌源性电位(cervical ves⁃tibular-evoked myogenicpotential,cVEMP),本试验所记录的是颈部肌前庭诱发肌源性电位(cVEMP)
小型猪与人在解剖学、生理学上有极大的相似性[2],并且体重轻,生长慢,便于实验操作,小型猪作为实验动物已经在肿瘤、心血管系统疾病、糖尿病、外科、口腔、烧伤整形、血液系统疾病、遗传代谢疾病和新药安全性评价等生物医学研究的多个方面取得了可观的成果[3];目前,小型猪作为实验动物在耳科中的研究还处于起始阶段,与其他常用的啮齿科动物相比,小型猪在耳的解剖结构具有独特的优势:1)、小型猪具有中耳鼓室结构和完整的乳突气房;2)其听骨链的形态结构和耳蜗的大小及显微结构等都与人极为相似;3)尤其前庭的形态结构和相对位置与人的最为接近[4];因此,用小型猪作为VEMP检测的实验动物是最佳之选。目前,国内外仅有少量相关的文献报道,利用豚鼠、小鼠进行VEMP的观察研究[5-7],仍缺少正常小型猪的VEMP检查方法。本实验选取正常的广西巴马小香猪作为实验对象,介绍VEMP的检查方法。
2.1实验动物
12头正常的小型巴马香猪(由中科院北方大动物研究基地提供),检查外耳道无异常分泌物,无步态不稳、头左右晃动、四肢外展及无力、躯干卷曲、强迫环行运动(转圈)等平衡功能异常表现。取出生后6个月,体重25kg左右,雌性小猪进行VEMP测试。
2.2麻醉
小型猪生性警觉性强,易躁和产生攻击行为,清醒状态下无法配合进行VEMP测试,因此,必须麻醉后才能进行试验,为了减少麻醉剂对实验的影响,我们采用联合用药,使用麻醉时间相对较短,对肌肉紧张性影响相对较小的戊巴比妥钠进行麻醉,并用速眠新进行麻醉诱导;以3%戊巴比妥钠(1ml/kg,北京普博斯生物有限公司)+速眠新Ⅱ(0.1ml/kg,吉林省华牧动物保健品有限公司)给予实验动物肌肉注射麻醉,实验前禁饲12 h,速眠新Ⅱ行颈部肌肉注射给药,同时3%戊巴比妥钠静脉给药,速度约2mL/min;5min-10min即出现精神沉郁、活动减少、四肢无力、步态不稳、喜卧等表现,表明已进入麻醉状态;以角膜反射、疼痛消失为标志表示麻醉成功;本试验所用的麻醉药物有肌肉松弛作用,影响实验动物记录部位骨骼肌的收缩,因此,在记录部位肌肉松弛和紧张状态下分别做VEMP的记录,以做辨别;为排除听觉功能可能对本试验存在的影响,本试验同时做了该试验动物的ABR。
临床上常用胸锁乳突肌上记录到的VEMP,来评估前庭功能尤其是球囊功能,但由于其检测需要保持较大的胸锁乳突肌紧张性收缩,在老年人及颈部疾患的人群中记录受限制;小型猪颈部在解剖上与人有所差异,脂肪组织较厚,其颈部伸肌在解剖和功能上与人的胸锁乳突肌相似[8],颈部伸肌位于其颈部两侧,是颈部最为粗大的肌肉,其起于肱骨嵴,止于枕骨和岩颞骨,支配头部的旋转、抬头等,其表面较厚的脂肪组织覆盖,不易触及;有学者在年人及颈部疾患的人群中咬肌上记录到前庭诱发的肌源性电位,用于年老者及颈椎病患者进行前庭肌反射检测[9];谢溯江等[10]在清醒豚鼠上记录的强短声诱发的咬肌肌源性电位,并确定了该电位的起源,是VEMP的良好补充;小型猪的咬肌,较为粗壮发达,近似正方形,起自颧骨,止于下颌支该肌肉表面有面皮肌和面神经,深面主要覆盖下颌支[8];位置表浅、肌肉粗大、易操作;我们尝试在小型猪的颈部伸肌和咬肌上进行诱发VEMP。
本试验对小型猪进行VEMP测试选用的设备是美国智听( HIS)公司的Smart EP诱发电位仪(美国智听公司),来记录肌电位,带通滤波30-3kHz,肌电图信号放大30k。开放声场,极间电阻<3Ω,分析时窗是50ms,疏波短声0.1ms,短声刺激叠加次数128次,频率1000Hz。每只动物进行一系列的强短声诱发的肌源性电位测试,刺激强度从120dB开始,每次下降5dB,直到波形消失,以确定阈值。采用这个阈值强度,连续进行2次记录,以检验其重复性;由于小型猪表皮及皮下脂肪较厚,我们采用自制银质电极针(银镍合金,纯度90%,直径0.9mm,长度5cm),表面进行聚四氟乙烯涂层,以防止其氧化,增加阻抗;之后用指针式电流表,对所制电极进行检测;从颈部伸肌和咬肌两个部位分别进行VEMP的检测,对其检测结果进行比较。
3.1颈部伸肌诱发的VEMP
记录颈部伸肌诱发的VEMP时,需要颈部伸肌保持较大的肌紧张性,动物麻醉后肌张力下降,不容易引出肌源性诱发前庭电位,我们首先进行颈部伸肌肌肉松弛状态下的VEMP的记录;之后,我们把小型猪俯卧在测试台上,使用自制装置使其头颈部转相对侧,与躯干约成45°,人为的使颈部伸肌保持肌肉紧张性,使肌张力增强;通过自制装置,可使咬肌肌肉紧张,从而记录到肌源性诱发前庭电位;在测试前把舌体从口腔中拉向一侧,防止后坠堵塞气道;把记录电极放置颈部伸肌分叉处(约其中上1/3处,此处肌纤维数量较多、体积较大、收缩较强),参考电极插入颅顶骨顶嵴表面的骨膜上,接地电极插入吻突(深度约2cm),极间电阻<3Ω;在测试过程中,由于用戊巴比妥钠麻醉,其气道会出现分泌物,应注意观察,防止意外的发生;观察在不同声强刺激之下VEMP波形特点及判断阈值,以第一个出现正向P波的消失作为判断阈值的指标。
3.2咬肌诱发的VEMP
由于动物麻醉后肌张力下降,不易引出肌源性电位,我们首先进行记录咬肌肌肉松弛状态下的VEMP的记录;之后,我们把小型猪俯卧在测试台上,口中衔一自制木棒(椭圆形、长15cm),木棒上缠绕适当纱布,以增加其在口中的摩擦力,防止木棒在口中滑脱,这样可使咬肌保持一定的紧张性,通过自制木棒,使咬肌获得紧张,从而记录到肌源性电位;将记录电极针插入测试侧咬肌前下1/3中部,参考电极插入颅顶骨顶嵴表面的骨膜上,接地电极插入吻突(深度约2cm),极间电阻<3Ω;在测试过程中,注意观察动物的状态,如有不适及时调整;观察在不同声强刺激之下VEMP波形特点及判断阈值,以第一个出现正向P波的消失作为判断阈值的指标。
3.3ABR记录
测试选用的设备是美国智听( HIS)公司的Smart EP诱发电位仪(美国智听公司),来进行ABR的记录。电极插放位置:检测用自制银制电极(VEMP检测所用电极),记录电极放置颅顶中点,自制电极针插入颅骨内硬脑膜,参考电极置于记录部位的耳垂处,线接于鼻尖;电极间的阻抗<3Ω;测试软件设置:刺激声为短声(click),刺激强度20-100dB SPL,以10dB进行递减,滤波为100-3000Hz,以Ⅴ波的消失作为判断其ABR阈值的标志。
图1 A/B为颈部伸肌和咬肌松弛,其余实验条件不变的情况下所引出的波形,P波未引出Fig.1 A/B:The neck muscle and masseter muscle relaxation of P wave can not be evoked,and The remaining experimental conditions are unchanged.
图2 在小型猪不同部位引出的VEMP图形Fig.2 Waveform of VEMP in different parts.
图3 小型猪测试时的摆放姿势Fig.3 pose of mini pigs during test
A/B Pose of mini pigs when detecting the neck extensor VEMP:open field,away from the ear margin of about 5cm,head and neck to opposite side,and the trunk of approximately 45 degrees,in order to make the fixed head,we use the fixed belt fixed;C/D for miniature pigs were placed in the position of masseter muscle VEMP test,open field,and about 5 cm from the ear,we put a stick in the mouth,the masseter muscle to maintain certain muscle tension.
AB为小型猪进行颈部伸肌VEMP检测的摆放姿势,开放声场,距耳缘约5cm,头颈部转向对侧,与躯干约成45°,为使头部固定,我们用固定带进行固定;C、D为小型猪进行咬肌VEMP检测的摆放姿势,开放声场,距耳缘约5cm,我们在其口中放一木棒,使其咬肌保持一定的肌张力。
图4 A/B为小型猪左、右耳正常ABR波形(dB SPL),阈值为25dB SPL。Fig.4 The normal ABR waveform (SPL dB) was detected in the mini pigs,and the threshold value was SPL 25dB.
临床上,VEMP常用于评价一些神经耳科学疾病,如听神经瘤、梅尼埃病、前庭神经炎、上半规管裂综合征、多发性硬化症、良性阵发性位置性眩晕、前庭性偏头痛以及其它外周或中枢性前庭疾病;人类在骨骼肌上记录到的前庭诱发肌源性电位的振幅,与其肌张力的大小呈正相关[11,12],振幅的绝对值的差异可能只受肌肉张力的影响,而与前庭功能是否正常无关[9],由于记录条件的限制,我们暂时还没有合适的方法在本实验中去检测背景肌肉的肌电活动的强度,因此没有进一步去探讨反射的振幅;肌源性前庭诱发电位检测目标包括刺激音声强阈值、潜伏期、P13-N23振幅等[13]。有很多因素影响前庭诱发肌源性电位检测峰值和潜伏期,如测试者的性别、年龄、肌肉自身特点、皮下脂肪厚度、皮肤电阻抗特性、刺激强度、电极安放位置及测试设备等;在本实验测试中,随刺激强度的下降,只有振幅降低,潜伏期没有明显变化;两种方法的P13波潜伏期7-9ms之间,N23的潜伏期10ms左右,所得的P波电位具有良好的重复性和稳定性;所引出的N波(负向波)波幅较弱小,可能与我们所采用的方法使引部位的肌张力过小,不足以把N波引出。
为了排除听觉对VEMP的影响,对小型猪进一步做了ABR检测,在高强度声下其V波的潜伏期为5-6ms,阈值25dB SPL,而在不同部位所引出的VEMP,其潜伏期为7-9ms,阈值80dB SPL,因此,可以基本排除听觉对VEMP的影响;本试验所用的麻醉药物有肌肉松弛作用,影响实验动物记录部位骨骼肌的收缩,因此,我们在两个记录部位(颈部伸肌、咬肌)肌肉松弛状态下,做了VEMP的记录,我们所得到图形重复性较好,基线相对平稳,但P波未能引出(图1);之后,使用自制装置,使该部位肌肉紧张,进行记录,在潜伏期7-9ms记录到一个十分明显的第一个正向波P(如图2),但振幅相对较小;因此认为VEMP作为肌源性诱发电位,记录部位肌肉的紧张性,对VEMP的检测十分重要,目前还没有合适的方法在小型猪清醒状态下进行VEMP测试,麻醉剂对小型猪VEMP的影响还需进一步探究;麻醉效果的好坏对VEMP的测试起至关重要的作用;小型猪在麻醉状态下,减少了清醒状态下脑电活动、头部运动、躯干及四肢肌肉运动干扰诱发电位的引出。3%戊巴比妥钠可肌肉注射、静脉推注也可腹腔给药;本实验采用静脉给药方法,无论采用何种给药方式,单用3%戊巴比妥钠常会出现全身肌肉颤抖,影响测试结果,速眠新Ⅱ作为肌松药物,可以减少肌电的干扰;速眠新Ⅱ虽具有良好的镇静、肌松和微弱的镇痛作用,但对呼吸和心脏有抑制作用,并使唾液腺及气管腺体分泌增加[14],应保持气道通畅,防止误吸;戊巴比妥钠对呼吸系统有抑制作用,抑制作用的强弱与药物的剂量和推药速度有关,速度越快,呼吸抑制的发生率也越高[15],因此,在测试过程中要密切观察实验动物的体温、呼吸频率、心率以及皮肤粘膜颜色等,如发现异常情况及时干涉;麻醉时间的长短与给药的部位、方式等有关,一般颈部肌肉给药可维持3h-4h;在麻醉过程中需注意:严格掌握麻药的剂量,遵循麻醉“宜浅勿深”的原则[16]。
由于在相同强度的声刺激下,神经肌肉反射的兴奋性,与肌肉的紧张程度密切相关[17],因此为了保持肌肉紧张性,在实验测试过程中,使用特定的装置以牵引记录部位的肌肉,使其保持一定的肌张力;强声诱发的肌源性电位的潜伏期的长短,可能与实验动物的神经传导时间短有关,在强短声诱发的小型猪咬肌肌源性前庭电位的潜伏期范围为6-8ms,与强短声在小型猪的颈部伸肌上诱发的肌源性前庭电位的潜伏期范围是一致的,低于正常人咬肌反应的潜伏期[12,18],但比大鼠在颈伸肌上记录到的肌源性反应的潜伏期稍长[18,19]。
通过本次实验,颈部伸肌和咬肌在强声下诱发的肌源性前庭电位潜伏期一致,只是在颈部伸肌部位所记录到的VEMP波幅稍高于咬肌部位记录到波幅,可能与记录部位肌肉的紧张程度有关;由于颈部伸肌位置较深,表面脂肪组织较厚不易定位,人为使肌肉紧张较为困难,并且在记录过程中实验动物易出现呼吸不畅意外情况,不利于肌源性诱发前庭电位的记录;而咬肌肌位置表浅,便于定位,肌肉组织发达,肌紧张性强,利于肌源性诱发前庭电位的记录咬。除了胸锁乳肌、咬肌外,也有文献报道有学者采用斜方肌(颈伸肌)作为记录部位也可获得相近的结果[10]。也有报道在手臂或腿部都可以记录到前庭诱发肌源性电位[20],在小型猪进行观察前庭肌源性诱发前庭电位的观察还有许多方法可以尝试,还需要进一步研究寻找更为适合的VEMP记录方法。
表1 不同刺激强度下VEMP不同参数的引出(n=12)Table 1 Response rate and parameters of BEMP in differernt stimulus intensity groups(MeanSD,n=12)
注:颈部伸肌、咬肌VEMP的潜伏期、波幅及引出率比较,二者P波的潜伏期从随着刺激强度的降低,潜伏期逐渐延长;P波波幅从随着刺激强度的降低,波幅逐渐降低;在100dB SPL、90dB SPL时,P波的引出率为100%,80dB SPL时颈部伸肌的引出率稍高于咬肌。
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Vestibular-evoked myogenic potentials in miniature pigs
LI Ya ,ZHANG Yue ,ZHAO Lidong ,GUO Weiwei ,PAN Hongmei ,ZHANG Liang ,YUAN Shuolong ,REN Lili ,SHI Xi ,QIAO Yuehua
1Xuzhou Medical College listening Center,Xuzhou 221006,China.2Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China.3 Clinical hearing center of Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221006,China.4Key Laboratory of Pig Industry Sciences (Ministry of Agriculture),Chongqing Academy of Animal Science,Chongqing 402460,China.
Corresponding author:QIAO YuehuaEmail:oto8558@163.com
【Abstract】Objective To report detection of vestibular-evoked myogenic potentials (VEMP) in the miniature pig.Methods Potentials evoked by 1000 Hz tone bursts were recorded from neck extensor muscles and the masseter muscles in normal adult Bama miniature pigs anesthetized with 3% pentobarbital sodium and Sumianxin II.Results The latency of the first positive wave P from neck extensor muscles was 7.65±0.64 ms,with an amplitude of 1.66±0.34 uv and a rate of successful induction of 75% at 80 dB SPL.The latency of potentials evoked from the masseter muscles was 7.60±0.78 ms,with an amplitude of 1.31±0.28 uv and a rate successful induction of 66% at 80 dB SPL.Conclusion The latencies and thresholds of VEMPs recorded from neck extensor muscles and the masseter muscles appear to be comparable in normal adult Bama miniature pigs,although the amplitude recorded from neck extensor muscles seems to be higher than that from the masseter muscles.However,because of their usually relatively superficial and easily accessible location,as well as their large volume and strong contractions,masseter muscles may be better target muscles for recording myogenic potentials.
【Keywords】vestibular evoked myogenic potentials; miniature pig; masseter myogenic potential
收稿日期:(2016-01-04)
通讯作者:乔月华,Email:oto8558@163.com
作者简介:李亚,硕士,研究方向:耳科学基础研究
基金项目:国家973计划重大科学研究计划干细胞项目(2012CB967900);国家973计划重大科学问题导向项目(2011CBA01000);国家自然科学基金(面上项目81271082,81470684,青年项目81400472);江苏省临床医学科技专项b12014032,江苏省六大人才高峰2014-WSN-043,中国博士后基金2015M571818,江苏省高等学校大学生创新创业训练计划201510313003Z;重庆市基本科研业务费项目(11611,14440)。
DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.005
【中图分类号】R339.16
【文献标识码】A
【文章编号】1672-2922(2016)01-21-6