接触DNA常规提取纯化方法的比较探讨

陈雨 臧悦含

（中国刑警学院 辽宁沈阳 110035）

接触DNA常规提取纯化方法的比较探讨

陈雨 臧悦含

（中国刑警学院 辽宁沈阳 110035）

接触DNA的提取纯化是法医物证工作的重点和难点之一。接触性检材上的脱落细胞本就量小体微，所以运用有效的方法对这些潜在的微量脱落细胞中的DNA进行提取纯化就显得十分重要。文章拟对接触DNA的常规提取纯化方法及影响因素进行简要阐述，并对其进行横向的比较探讨，以期得出最有效的接触DNA提取纯化方法。

接触DNA 提取纯化 影响因素 比较探讨

接触DNA是指通过皮肤与检材接触而在检材表面留下皮肤脱落上皮细胞的DNA，脱落细胞多数为角化的上皮细胞，肉眼无法观察到，具有易污染、易降解、载体大、DNA量少等特点。目前常用的接触DNA提取纯化方法主要有Chelex-100法、磁珠法、硅珠法、有机溶剂法、过柱法、直扩法等。针对不同类型的接触性检材应采取不同提取纯化方法。

1　常规提取纯化方法

1.1Chelex-100法

Chelex-100是一种螯合树脂，是以亚氨基二乙酸为吸附因子的苯乙烯与二乙基苯的共聚体，其中亚氨基二乙酸侧链起到螯合金属离子的作用。在低离子强度、低碱性、100℃条件下细胞膜破裂，蛋白质变性，使DNA游离出来。Chelex-100通过螯合金属离子，抑制核酸酶对DNA的酶解作用。离心后，使Chelex-100颗粒及变性蛋白质沉淀，DNA留在上清液中，可用于PCR扩增的模板使用。

采用 Chelex-100法时需要注意：Chelex-100放置后会有沉淀现象，使用之前需要摇匀。

Chelex-10置于空气中一段时间后PH值会下降，故使用前需要用纯水清洗。若检材陈旧或有杂质可事先清洗或延长浸泡时间。

1.2磁珠法

磁珠法提纯接触DNA的原理是利用细胞裂解液使细胞裂解进而使DNA分子游离出来，DNA分子带负电可以被吸附到磁珠表面。然后在磁场的作用下使磁珠与液体分开，回收磁珠颗粒，洗涤后，再用纯水或TE洗脱磁珠吸附的DNA。采用不同的试剂盒提取过程会略有差别。

1.3硅珠法

硫氰酸胍是一种强蛋白质变形剂。高速离心后可以使变性蛋白质与DNA分离开，并去除其他不溶性杂质。溶液中加入二氧化硅微粒，DNA能够被二氧化硅特异性吸附。被吸附的DNA在没有硫氰酸胍存在的条件下又可以从二氧化硅上解离。再经过漂洗可将溶液中的PCR抑制物去除，最后得到纯净的DNA溶液。

采用硅珠法时要注意：1、裂解液的量一定要完全浸没检材；2、吸附过程中加硅珠之前要先离心一次，保证硅珠的吸附性；3、洗脱液不要太多，必要时可以结合其他方法进行纯化。

1.4直扩法

直扩法是一种免提取扩增方法，即不需要DNA的提取步骤而是直接将适量检材直接用于PCR扩增快速得到STR分型。目前已经研制出多种用于直接扩增的试剂盒，其中接触D N A提纯多采用Identifiler Direct PCR直扩试剂盒。

具体操作：扩增的体系因检材的不同会有所区别，这里以烟蒂为例做简要介绍，首先取适量引物Primer、Master mix混匀后置于扩增管中；然后剪取烟蒂唾液斑处适量，将检材置于扩增液中以完全浸没为准，扩增参数可以选择95℃11min变性、72℃1min延伸、59℃2min复性为一个循环体系，循环30次。

直扩法在操作过程中要注意判别脱落细胞的位置，转移的检材大小要适中，过大会产生PCR抑制或混合污染现象，过小有可能会检不出接触DNA，因此要结合生活工作经验提取。

2　比较讨论

采用Chelex-100法提取的检材，优点是适用范围广、操作简便成本低，整个过程只在一个EP管中进行，损耗和污染少提取DNA的量较多。缺点是对于提取液中的杂质、小片段DNA、蛋白质、PCR抑制物等无法去除。此方法适用于脱落细胞较多、杂质少、DNA提取条件较好的检材。

磁珠法提取接触DNA灵敏度较高，整个过程中不需要离心，操作简便，不含有色素、蛋白质以及PCR抑制物，或者含量极少不影响分型，纯度较高。整个自动化提取DNA的过程在同一反应管中进行，样品损失较少，提取的DNA纯度较高，只要模板量超过2ng就可以进行性别分型及10个基因座以上的STR分型。利用磁珠法可以去除100bp以下的小片段DNA，减少STR扩增时出现的小片段优势现象，产物峰也比较均衡。因此磁珠法更适用于陈旧性、接触性等疑难微量检材。

硅珠法提取接触DNA的灵敏度较高，提取时间短，纯度高。改良硅珠法优势主要在于：1、应用离心套管无需移管；2、吸附液量增大，充分吸附；3、漂洗次数减少；4、洗脱体系减小等。改良硅珠法提纯的接触DNA质量更高，STR分型成功率更大。适用于犯罪现场的多数检材，一般不受检材的限制。

直扩法的优点在于操作简便、节省时间、所需检材量小、检出率高等，操作步骤较少，DNA丢失现象少使得检出率大大提高。但直扩法适用范围较小，仅适用于干净、保存条件好的检材，对于污染严重、腐败陈旧等PCR扩增抑制物较多的检材则需要慎重考虑。

当检材脱落细胞较多、杂质少、提取条件好时可采用Chelex-100 法提取接触DNA；当检材上脱落细胞较少、检材陈旧腐败、杂质较多时可以采用Chelex-100联合磁珠法或者Chelex-100法联合硅珠法进行提取纯化；当需要检验的检材数量较多，且检材保存条件比较好，例如DNA数据库的建设时可以选用直扩法直接扩增分型。

［1］刘海渤，冯保强，黄颖等.3种提取接触性检材脱落表皮细胞DNA 方法的实验研究［J］.昆明医科大学学报.2012，（12）：36～40.

［2］姚建，贾东涛，张玉红.检材量对硅珠法提取脱落细胞DNA的影响［J］.中国法医学杂志.2009，24（5）：333.

［3］杨电，张丽萍，刘超.Chelex法和两种磁珠法提取接触DNA效果的比较［J］.刑事技术.2012，1：11-13.

［4］董迎春，李诗柳，朱怡.改良硅珠法提取 DNA 的灵敏性及稳定性评价初探［J］.中国法医学杂志.2015，30（1）：59-61.

［5］杨电.接触DNA检材提取纯化方法的比较及法医学应［D］.南方医科大学.2007.

［R89］

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1674-2060（2016）05-0154-01