多重PCR技术在食品微生物检测中的应用进展

周志如

（海南师范大学生命科学学院 海南海口 571158）

多重PCR技术在食品微生物检测中的应用进展

周志如

（海南师范大学生命科学学院 海南海口 571158）

PCR（聚合酶链式反应）技术由于具备操作方便、快速和灵敏等优势，并且能够同时扩增不同的目的基团，在微生物检测当中受到了越来越广泛的应用。多重PCR技术的研究对于高效快速检测的意义重大，逐渐成为了当下的研究焦点。本文将对多重PCR技术的原理作出分析，并探讨其在微生物检测中的应用、问题及改进方法。

多重PCR技术 食品微生物检测 应用进展

当前的食品行业中存在许多危害食品品质与人类健康的有害微生物，必须通过敏感、快速、有效的检测手段来及时发现、控制致病菌，以降低其危害。多重PCR技术突破了传统检测手段用时长、操作繁琐的局限，在微生物致病菌检测方面得到了日益广泛的应用。

1　食品微生物的检测方法

传统的食品微生物检测主要有培养法和免疫学方法，其中培养法需历经赠菌或前增菌、分离、培养和生化、血清学鉴定等多个繁琐流程，十分的耗时耗力。而具有高敏感度和特异性的免疫学方法极易受复杂的微生物血清型影响，容易出现假阳性状况，检测结果不够精确。随着现代科技的进步，以PCR技术为基础的分子生物学检测技术发展迅速，因其操作快捷、成本低廉且特异性和灵敏性强，在食品微生物检测中受到了越来越多的青睐。

2　多重PCR技术及原理

聚合酶链式反应（PCR）指的是单链DNA模版在体外条件和DNA聚合酶作用下产生DNA片段特异性扩增的技术，经历变性-退火-延伸流程。首先把双链DNA所热变形成的单链DNA靶序列与人工合成引物相结合，引物受DNA聚合酶作用沿DNA单链由5′末端延伸至3′末端并合成双链，使其作为模版在聚合酶反应下又形成新的DNA双链，反复循环。多重PCR是将两对及以上引物加入同一个反应体系中，扩增出多个DNA序列或目的基因。

3　微生物检测中多重PCR技术的应用

（1）应用于食品病原微生物的检测。主要包括：①沙门氏菌。沙门氏菌易因食品成分干扰或食品加工而损伤，影响检测准确性。多重PCR能够对沙门氏菌血清型、突变状况进行准确的鉴定，提升沙门氏菌检测率。目前属特异性引物基因hilA、hns、fimA等与血清型特异性引物基因、血清群特异性引物基因是检测沙门氏菌的主要靶基因；②金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌能够繁殖生成引发食物中毒的肠毒素SE，广泛存在于生肉、发酵肉类和蔬菜当中，其相关检测基因包含sea、seb等基因；③肠出血性大肠杆菌。大肠杆菌具有十分相似的产毒素，检测时以紧密素基因eae、鞭毛基因fliCH7等作为目的基因。

（2）应用于食品非致病菌的检测。乳酸菌对病菌生长具有很好的抑制作用，但也常预示食物的腐败。食品真空包装中往往存在含量低却可繁殖生长的乳酸菌，多重PVR检测可判断真空包装食品的腐败情况。

（3）应用于食品相关环境微生物的检测。外界环境当中广泛分布着不动杆菌和导致医院感染的鲍氏不动杆菌，以碳青霉烯类耐药株增加为主要特性的多重耐药鲍氏杆菌增加给食品安全带来了严重威胁，另外，以寄生曲霉为主要病原的黄曲霉中的毒素可致癌。相关研究显示，多重PCR技术在不动杆菌、黄曲霉等的检测上具有很高的准确度。

4　微生物检测中多重PCR技术存在的问题与改进

（1）问题。在应用食品微生物的多重PCR检测技术时，多对引物可能相互抑制并结合非靶序列出现非特异性扩增。受到食品复杂成分的感染以及微生物含量低的影响，含PCR抑制成分的样品会降低检测灵敏度，出现假阴性结果，不利于多重PCR技术在食品微生物检测中的普及。

（2）很多学者为了实现最佳多重PCR体系与反应条件的优化，采取了差速离心、免疫磁珠吸附等技术来对样品前处理效果做出提高，降低了抑制因子的作用。结合实时荧光定量PCR能够定量拷贝数并免除后处理，具有准确、特异和高效的优势，但设备成本高，同时检测结果可能受引物探针含量、外缘DNA等的干扰，在样品处理过程简化和检测成本降低方面还有待改进。结合DGGE（变性梯度凝胶电泳）能够对不同碱基DNA片段混合物进行分离，通过条带数量和明暗程度反映微生物状况，操作简便且准确率高，与此同时因可分析样品容量较小，故目前仅使用在一些小DNA片段中，其图谱条带会在样品制备时发生改变。

5　应用进展

多重PCR检测技术效率高、速度块且特异性好，在食品病原微生物、环境微生物与非致病微生物的检测中意义重大，具有十分广阔的发展前景。多重PCR当前还面临着检测灵敏度不高、易受抑制因子感染等情况，当前的改进技术在一定程度上减少了检测的时间与成本，但同时也存在诸多问题。未来应当以样品前处理技术的改进和印制因子干扰的消除为研究重点，进一步提升多重PCR技术在食品微生物检测当中的有效性与可行性。

［1］柳洪芳，宋慧.PCR及其改进技术在食品微生物检测中的应用［J］.现代化农业，2012，01：34-36.

［2］王华，刘斌.PCR技术在食品微生物检测中的应用［J］. 生物技术通报，2010，02：63-67.

［3］吴海华.多重PCR快速检测技术在食品致病微生物检测中的应用［J］.现代食品，2015，17：43-45.

TS207

A

1674-2060（2016）05-0097-01

周志如（1993—），女，海南东方，海南师范大学2012级本科生， 研究方向：生物技术。