与时俱进的SSR分子标记技术及其在水稻中的应用

李筠

（深圳农业科技促进中心 广东深圳 518000）

与时俱进的SSR分子标记技术及其在水稻中的应用

李筠

（深圳农业科技促进中心 广东深圳 518000）

SSR标记又称为微卫星标记，具有共显性、多态性高、易检测等优点，是目前被广泛应用的一种分子标记。随着分子生物技术的不断发展，SSR分子标记技术也日趋成熟完善，有条件的实验室实现了高通量自动化的技术流程。SSR分子标记技术在水稻DNA指纹图谱的构建和品种真实性鉴定、遗传图谱的构建、基因的定位和图位克隆以及分子标记辅助选择育种等方面有着广泛的应用。

SSR分子标记 水稻 DNA指纹图谱

SSR标记（simple sequence repeat）也称为微卫星标记，是分子标记中的一种，是指以少数几个核苷酸（2～4个）为单位的串联重复序列。SSR分子标记技术在水稻研究中发挥着至关重要的作用，利用该技术构建的DNA指纹图谱数据库，为品种真实性鉴定、种质资源鉴定，育种材料确权等提供了强有力的技术支撑。同时，利用SSR分子标记技术绘制水稻遗传图谱，进而研究水稻具有重要农艺性状的基因，对这些基因进行QTL分析、精细定位和图位克隆，进行分子标记辅助选择育种等，为水稻分子设计育种奠定了坚实的基础，最终将可实现“想要怎样的稻米，即可创造怎样的稻米”的梦想。

1　SSR分子标记的优点

目前，分子标记可分为四大类：一是基于DNA-DNA杂交的分子标记，如RFLP标记；二是基于PCR与限制性酶切技术结合的分子标记，如AFLP标记、CAPS标记等；三是基于PCR的分子标记，包括随机引物PCR标记（如RAPD标记）和特异引物PCR标记（如SSR标记、STS标记）；四是基于DNA测序的标记，如SNP，Indels，EST标记。与第一、二类分子标记相比，SSR标记具有以下优点：（1）在染色体上覆盖率高，数量多，且是共显性标记；（2）在基因座位上存在着丰富的等位基因，即多态性高。例如，水稻RFLP座位的等位基因数为2-4个，而SSR标记的等位基因数为2-25个。从多态性信息含量（PIC）来衡量，RFLP的PIC值为0.39，而SSR标记的PIC为0.69；（3）实验重复性较好，结果可靠性高；（4）基于PCR技术上的操作，具有快速、简便、低成本的特点。与第四类分子标记相比，SSR标记虽然在染色体上的覆盖率不及SNP标记，但SNP标记的研究毕竟起步晚，在水稻很多方面的应用中仍处于研发阶段，且开发SNP标记的成本目前也相对较高。因此SSR标记是一类比较理想的分子标记，目前正广泛应用于水稻的研究中。

2　SSR分子标记技术的发展

2.1SSR分子标记电泳技术的发展

SSR分子标记技术在实验操作过程中，主要包括4个步骤：样品制备、DNA提取、PCR扩增和PCR产物检测。经过多年的发展，该技术已经非常成熟。以前，PCR产物检测采用的是聚丙烯酰凝胶电泳技术，包括变性胶和非变性胶两种方法。然而，不管采用哪一种方式，都需要经过制胶、染色和显影的步骤，实验过程相对繁琐，耗时长，而且未能直观分析片段大小的精确值，难以区分差异2bp以下的片段。现在，PCR产物检测可以采用毛细管电泳技术，实验操作简便，能精确知道每个材料SSR标记的片段大小值，而且可以实现多重毛细管电泳，例如在人类基因组研究上可以实现24重电泳，在玉米的研究上可以实现10重电泳，而在水稻的研究上可以实现4-5重电泳，大大提高了实验效率，省时省力且结果准确可靠。

2.2从人工操作到高通量自动化流程的发展

实现实验流程自动化是SSR分子标记技术发展的一个重要趋势。以前实验过程完全是靠人工来完成，现在各种自动化仪器的引进，在解放劳动力的同时，避免了人为因素造成实验过程操作的失误。DNA提取过去采用的是SDS法，CTAB法等，均可提取高质量DNA；现在可采用DNA自动化提取技术，当前比较流行的是磁珠法核酸纯化技术，该方法采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，通过同核酸发生吸附反应来达到提取和纯化DNA的目的［1］。PCR扩增过去完全是人工操作，每次实验需要实验人员按扩增体系比例配置引物、DNA样品、酶，ddH2O等，现在可以采用自动移液工作站，可自动实现96通道的快速操作。PCR反应也从过去的2个小时减少到30分钟。目前大型种业先锋、孟山都公司已实现自动化，每天处理的用于玉米育种的单个分子标记数据达到20万个，国内各省市科研院所，种子管理站也逐渐引进自动化仪器，实现高通量自动化流程。

3　SSR分子标记技术在水稻研究中的应用

3.1水稻DNA指纹图谱的构建和品种真实性鉴定

构建DNA指纹图谱数据库可从分子水平上鉴别新品种与已审定品种是否存在差异，从而科学、快速的判定品种间的特异性、一致性和稳定性；也可用于市场上真假品种的鉴定。目前，中国农业科学院水稻所已利用48对SSR标记基本完成对3000多份水稻主推品种的指纹图谱构建；而最早是在2001年，中国水稻所于永红应用筛选出的4对SSR引物，建立了杂交水稻不育系宁2A以及宁2B的DNA指纹图谱［2］，通过与其他广泛应用的杂交水稻亲本材料的遗传关系分析，发现宁2A、2B具有籼稻的遗传成分，从而在分子水平上解释了该材料与籼稻亲和性较高的原因。而后陆续有研究单位利用SSR分子标记构建水稻品种的DNA指纹图谱，四川、重庆、安徽、深圳等省市也分别对参加省区试和历年推广的水稻品种构建了DNA指纹图谱［3］。

2007年，农业部颁布了水稻品种真实性鉴定行业标准“NY/T 1433-2007”，利用12对基础核心引物和12对扩展核心引物对水稻品种进行鉴定。随着SSR标记技术的发展和DNA指纹图谱数据库的日益完善，2014年，农业部重新修订水稻品种真实性鉴定行业标准为“NY/T 1433-2014”，从24对SSR标记增加为48对SSR标记，从待测样品与标准样品的逐一进行两两比较的方法，增加了另一种方法，待测样品与DNA指纹图谱数据库的比较。这样，SSR标记对种子生产、经营、使用、管理等活动已起到重要作用。

3.2遗传图谱的构建

最先用于水稻遗传图谱构建的标记是RFLP标记，始于1988年美国康奈尔大学发表的连锁图，而后在日本RGP网站也公布了连锁图，且几乎为CAPS标记代替。这两张连锁图是各自独立构建的，所用标记和群体类型不同，因而不能互相参照。随后，随着SSR分子标记的广泛应用，美国康奈尔大学构建了水稻微卫星标记连锁图，图上的微卫星标记达2740多个，而华南农业大学分子育种重点实验室利用网上序列资料设计SSR引物对这些标记稀少的区域进行了填充和整合，重新构建了一幅包括719个SSR标记的图谱，这个图谱上SSR标记的分布较均匀，为水稻分子育种的准确性提供了保证。

3.3基因定位和图位克隆的应用

通过遗传图谱的构建，很多SSR标记在染色体上的位置已经确定，因此只要确定基因与分子标记之间的连锁关系，就可以确定基因在染色体上的位置。水稻基因定位包括主效基因的定位和微效基因的QTL分析两方面，前者如控制水稻花粉不育基因S-a，S-b，S-c，S-d，S-e的定位，后者是一些数量性状基因的定位。

1986年，剑桥大学的Coulson等提出图位克隆的概念，又称为定位克隆，该方法无须事先知道基因的DNA序列，利用SSR分子标记就可以直接对自然变异的基因进行精细定位，进而进行克隆。水稻方面，各个性状的基因已有很多被克隆，如水稻粒长粒宽相关的GS3，GW5，GS5，GW8基因；控制水稻抽穗期的Ghd7，Hd1，Ehd1，Hd3a，OsMADS50，RFT1Hd6，DTH8，DTH2等基因，控制稻米品种的WX，ALK基因等都已被图位克隆。

3.4分子标记辅助选择育种（MAS）的应用

SSR分子标记最直接的用途是对水稻重要农艺性状进行辅助选择（marker-aided or assisted selection，MAS），也就是利用目标性状基因与分子标记之间的紧密连锁关系进行间接选择。结果十分可靠，且MAS一般可在育种早代时期完成，从而大大缩短育种周期，提高了育种效率［4］。

例如水稻产量性状相关基因中，与粒宽GW5 紧密连锁的SSR标记为RM3328和RM513，位于第5染色体短臂间［5］；Xue等找到与每穗粒数Ghd7紧密连锁的SSR标记为RM5436和RM2256［6］；与粒宽GS5紧密连锁的SSR标记为RM593和RM574［7］；与每穗实粒数相关的DEP1连锁的SSR标记为第9染色体上的RM3770和RM7424［8］。利用这些分子标记，能对育种材料进行快速的筛查，为分子设计育种奠定了坚实的基础。

4　结语

经过多年的发展，SSR分子标记技术在水稻研究中扮演着非常重要的角色，大力的促进水稻研究工作的前行。SSR分子标记技术也在日益发展，目前在有条件的大型种业公司或者经费充足的科研院所，该技术已逐渐实现自动化、高通量的流程，然而它也有弊端，就是这些进口仪器相对昂贵，且试剂耗材成本高，因此我们要加强仪器和试剂耗材方面的技术攻克，开发国内先进的仪器和高质量的试剂，同时对该技术各个环节的条件进行进一步优化和完善，减少时间和成本。另一方面，SSR标记的开发需要知道DNA序列才能设计引物，应该实现各实验室间已开发引物的共享，携手努力，这样才能更快更好的致力于水稻的研究工作。

［1］曹士亮，曹靖生，王成波，等.玉米SSR分子标记技术操作流程研究进展［J］.中国农学通报.2012，28（15）：1-4.

［2］于永红，李云海，马荣荣，等.用微卫星DNA标记建立2A的指纹图谱［J］.中国水稻科学.2001，15（3）：215-217.

［3］肖小余，王玉平，张建勇，等.四川省主要杂交稻亲本的SSR多态性分析和指纹图谱的构建与应用［J］.中国水稻科学.2006，20（1）：1-7.

［4］Knapp S J. Marker-Assisted Selection as a Strategy for Increasing the Probability of Selection Superior Genotypes［J］. Crop Science.1998，38：1164-1174.

［5］Wan X Y，Weng J F，Zhai H Q，et al.Quantitative Trait Loci （QTL）Analysis For Rice Grain Width and Fine Mapping of an Identified QTL Allele gw-5 in a Recombination Hotspot Region on Chromosome 5［J］.Genetics，2008，179（4）：2239-2252.

［6］Xue W Y， Xing Y Z， Weng X Y，et al.Natural variation in Ghd7 is an important regulator. of heading date and yield potential in rice［J］.Nature Genetics，2008，40（6）：761-767.

［7］Li Y B， Fan C C， Xing Y Z，et al.Natural variation in？GS5？plays an important role in regulating grain size and yield in rice［J］.Nature Genetics，2011，43（12）：1266-1269.

［8］Yan C J， Zhou J H，Yan S，Chen F，et al.Identification and characterization of a major QTL responsible for erect panicle trait in japonica rice （Oryza sativa L.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2007，115（8）：1093-1100.

Q75

A

1674-2060（2016）05-0088-02

李筠（1984—），女，广东省汕头市人，助理农艺师，定向博士在读，研究方向：植物分子育种。