牛奶中抗生素类兽药残留快速检测的研究进展

黄闯，吴勤民，孙芝杨，邵虎，孔令伟

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏省食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江苏淮安223001）

牛奶中抗生素类兽药残留快速检测的研究进展

黄闯1，吴勤民1，孙芝杨1，邵虎1，孔令伟2

（1.江苏食品药品职业技术学院，江苏省食品加工工程技术研究开发中心，江苏淮安223003；2.淮安快鹿牛奶有限公司，江苏淮安223001）

介绍抗生素类兽药残留的原因及危害，并讨论了磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、硝基呋喃类几种常见抗生素最新检测方法，最后对样品前处理和检测两个阶段的方法做出了总结及展望。

抗生素；样品前处理；检测方法；残留

兽药残留可分为抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类和β2肾上腺素能受体阻断剂。其中抗生素类残留危害巨大，已经引起世界各国和国际团体的高度重视。人长期摄入

含抗生素残留的动物性食品后，可造成药物积累，甚至产生耐药性，破坏胃肠道菌群环境，造成生态毒害。因此，食品中，特别是牛奶中抗生素残留的快速检测越来越受到人们的重视。

1 抗生素类兽药残留的原因及危害

兽药是用于预防和治疗畜禽疾病的药物。动物性食品中的兽药残留对人的潜在危害[1-3]愈来愈引起人们的重视：动物在反复接触抗生素等抗菌药物后，动物体内的耐药菌株会大量繁殖并传播给人，给临床治疗带来困难[4]；四环素、链霉素等药物及环境中的化学药品可引起致畸、致突变、致癌、生殖毒性等特殊毒性作用[5]；氯霉素、大环内酯类药物[6]等对人体产生的有害或不良生物学改变，导致急性、亚急性或慢性毒性作用；青霉素类等药物其代谢和降解产物产生过敏反应或变态反应，引起皮炎、皮肤瘙痒、过敏性休克，或危及生命；具性激素样活性的化合物作为同化剂用于畜牧业生产，其残留会影响人的正常性激素功能，甚至发生肿瘤。因此，快速、准确、经济、简便、多残留同时检测的技术研究非常关键[7-12]。兽药残留种类很多，按用途可以分为抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类药、生长促进剂和杀虫剂等。其中乳中抗生素残留日益受到关注[13]。

2 磺胺类药物残留检测方法的研究进展

目前动物性食品中磺胺类药物残留[14]的检测方法主要包括微生物检测法、分光光度计法、免疫分析法、色谱法及色/质联用技术等[15]。磺胺是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的药物，在动物体内分布广泛，血液中含量居首，肝、肾次之。磺胺通过干扰细菌的叶酸代谢而抑制细菌的生长繁殖。孙晶玮等[16]利用超声波提取，采用氯仿-丙酮进行液-液萃取处理，利用RP-HPLC、甲醇-水-乙酸为流动相进行直接分析，添加回收率达到81.98%～104.16%，标准偏差小于9.0%；胡海燕等[17]建立了牛奶中多种磺胺类药物残留检测的UPLC法，定量限为50μg/kg。郭伟等[18]建立同时测定牛乳中24种磺胺类药物多残留的UPLC-ESI-MS/MS分析方法。样品提取和净化采用的是经改良的QuEChERS技术，样品的平均回收率在64.2%～110.9%之间。倪姮佳[19]以生物素化的核酸适配体（biotin-SA07）为识别工具，合成出酶标抗原SM2-GA-HRP，建立了用于检测磺胺二甲嘧啶的直接竞争化学发光分析方法。该方法的检测限为0.92 ng/mL，线性范围为1.85 ng/mL～21.57 ng/mL。

3 氟喹诺酮类（FQs）药物残留检测方法的研究进展

氟喹诺酮类（FQs）药物合成抗菌药，抑制脱氧核糖核酸螺旋酶，阻碍细菌DNA复制，有广谱杀菌作用，副作用小[20-24]。FQs[25]大多不溶于非极性有机溶剂，易溶于冰醋酸、稀矿酸或稀碱溶液，对光不稳定。样品前处理方法包括液液分配、固相萃取、基质固相分散、在线透析等。液液分配是利用药物在有机相和水相间不同分配系数进行转移，除去干扰物质，如用氯仿或乙酸乙酯提取后，用碱性缓冲液抽提分析物，酸化后再用氯仿或乙酸乙酯提取水相。固相萃取（SPE）吸附剂一般为C18、氧化铝、氨丙基磺酸型和丙磺酸型离子交换树脂。在线透析和富集可以使药物分子穿过透析膜进入欲富集柱中用淋洗剂洗去杂质，再用洗脱剂洗脱至分析柱中而分离。FQs的检测方法主要包括生物测定法、分光光度法、色谱法及色谱-质谱联用技术等[26]。米铁军[27]建立了牛奶中FQs药物多残留检测的荧光偏振免疫分析方法，该方法是通过检测荧光标记抗原（和待测物）在与特异性的抗体竞争性结合前后FP值的变化，来定量计算小分子待测物的含量。孟哲[28]采用超高效液相色谱-四极杆-高分辨飞行时间质谱技术，快速筛查、定量分析乳制品中8种FQs药物残留，以体积比100∶1的乙腈-20%三氯乙酸溶液作溶剂和OasisHLB固相萃取净化，实现了目标物的同时提取和有效净化。邢广旭[29]结合了胶体金标记技术与免疫膜层析技术，合成人工结合全抗原，可在1min～5min内判定样品中是否有FQs。

4 四环素类药物残留检测方法的研究进展

四环素类包括四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等，是一类碱性光谱抗生素，与细菌核蛋白体30S亚基在A位特异性结合，阻止氨酰tRNA在该位置上的联结，阻止肽链延伸和细菌蛋白质合成，改变细胞膜通透性，抑制DNA复制。四环素[30]在0.03mol/L盐酸溶液中能保持长期稳定。牛奶等液体样品一般通过离心去除部分蛋白和颗粒，再用乙酸盐、磷酸盐、McIlvaine或McIlvaine/EDTA、琥珀酸盐、柠檬酸盐缓冲液、三氯乙酸等稀释。另可用超滤法提取牛奶。再进行液液分配、固相萃取（SPE）、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等净化处理。液液分配利用二氯甲烷等疏水性有机溶剂将脂溶性杂质洗去；SPE柱固定相多为C18、多聚类和环己基，另可将反相柱与阳离子交换柱串联使用，或混合填料使用；基质固相分散采用C18，搭配同份量的EDTA和草酸，可加快提取速度。乙睛一乙酸乙醋溶液洗脱，高效液相色谱（HPLC）法检

测，回收率范围是63.5%～93.3%，变异系数小于10%[31]。其他测定方法还有微生物测定法、薄层色谱、荧光分光光度法和毛细管电泳法。Stolker等[32]对牛奶中四环素类兽药残留进行了测定，采用StrataX SPE柱进行前处理，LC-TOF-MS进行测定。Koesukwiwat等[33]采用HLB柱进行净化，对牛奶中磺胺和四环素类兽药进行了检测，回收率为72.0%～97.4%，定量限为0.6 ng/mL～8.6 ng/mL。苏璞[34]建立了高通量的四环素类抗生素残留检测的悬浮芯片技术，检测限为0.05 ng/mL～781.25 ng/mL。

5 硝基呋喃类药物残留检测方法的研究进展

硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸等作用，1995年起欧盟禁止其在水产和畜禽食品中使用。该类药物代谢产物因与蛋白质结合稳定，故一般通过代谢物检测反映其原形药残留情况。牛奶等样品先用氯化钠稀释，或冷冻脱水，再用乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷进行提取。净化处理包括液液分配、固相萃取（SPE）、基质固相分离等。液液分配可在酸性条件下用二氯甲烷提取，加入氯化钠，效果会更好，加入正己烷可去脂质；固相萃取以C18、XAD-2应用最多；基质固相分离以C18用的最多。测定方法有薄层和液相色谱法，紫外、荧光、电化学或质谱检测。陶燕飞[35]建立了牛奶中硝基吠喃类药物代谢物的LC-MS/Ms定量确证方法。样品采用ASE提取，溶剂为甲醇/三氯乙酸，再用邻硝基苯甲醛超声衍生，用乙酸乙酯提取，HLB净化，分析物采用高效液相色谱/串联质谱定性检测。

6 结束语

为了人类和动物的健康，国际组织及多国均制定了严格的最大残留限量标准和检测方法[36]。兽药残留分析包括样品前处理和检测两个阶段[37]。前处理是除去蛋白质等干扰物质，并进行净化处理，使样品浓缩、稳定，以便于检测。常用的提取方法有：振荡法、索氏提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、快速溶剂萃取法等。净化主要包括液液萃取和固相萃取。目前样品前处理的趋势在于简化前处理过程。多残留分析要求应用简单、通用的样品前处理过程，使之能够适用于具有不同物理化学特性的多类别组分。QuEChERS方法也已用于不同食品中多类别兽药组分的测定，具有快速（quick）、简单（easy）、便宜（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）和安全（safe）的优点，一般用乙腈提取，通过用氯化钠和硫酸镁盐析的方法移除水分和蛋白质，以分散固相萃取的方式净化，最后通过LC-MS测定从极性到非极性的所有化合物。检测以HPLC和HPLC-MS/MS为主，多类别、多组分兽药的同时同步分析成为近年来兽药残留分析的发展趋势。液相色谱串联三级四极杆质谱和液相色谱串联高分辨质谱在兽药多残留分析中各有特色。随着消费者对无抗概念的兴趣日渐浓厚，开发快速、灵敏度高的抗生素检测方法也已经成为企业所面临的难题，也只有这样才能不断提高乳品的质量和企业的竞争力。

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Research Progress on Rapid Detection of Antibiotic Residues in M ilk

HUANGChuang1，WUQin-min1，SUN Zhi-yang1，SHAOHu1，KONG Ling-wei2
（1.Food Processing Engineering Technology Research and DevelopmentCenterof Jiangsu Province，Jiangsu Food and Drug Vocationaland TechnicalCollege，Huai'an 223003，Jiangsu，China；2.HUAIAN KUAILU MILKCO.，LTD.，Huai'an 223001，Jiangsu，China）

The causeand harm of Antibiotic residuesofveterinary drugswere introduced.Therearenew detectionmethodsofseveral common antibiotics，which contain sulfonamides，quinolones，tetracyclines，nitrofuran arealso discussed.At last，themethodsofsamplepretreatmentand detection aresummarized and expected.

antibiotics；samplepretreatment；detectedmethods；residues

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.051

2016-08-22

黄闯（1981—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品营养与安全。